同基因小鼠黑色素瘤细胞注射，以确定其在肺转移潜能

伦理声明：在研究中使用的小鼠只有在它可能会推动基础生物学或对疾病的治疗最终人类认识的实例可以接受的。 1.订购购买的雌性C57BL / 6小鼠（6岁 – 8周），每组5只小鼠。允许几天的老鼠进行调整。 2. B16-BL6细胞的制备在无菌罩中删除从37度培养箱和地点细胞培养板。板材应该是大约70汇合与B16-BL6小鼠黑色素瘤细胞％。更大的融合可能会改变细胞的转移潜能。 加入1毫升0.05％的胰蛋白酶-EDTA每板，让坐在1分钟，然后吸出胰蛋白酶的培养基溶液。 加入1ml每板胰蛋白酶，并返回板的孵化10分钟。 从孵化器中移动板到无菌罩后，加入4毫升的无血清罗斯维尔公园纪念研究所Mediu的米（RPMI），以每块板。 收集用无菌，机动吸管细胞。喷射细胞对所述板的底部，以在非常微小的角度按下尖，打散细胞。为了确保细胞团块，否则可能堵塞的喷射针的足够的分离重复数次。回忆并转移到50毫升锥形管中。 使用血细胞计数器确定细胞密度。保持B16-BL6细胞的总数不变，确定无血清RPMI的体积需要达到0，0.065，0.015，0.25和0.5百万个细胞/ ml的最终浓度。 同样等分在50ml管中的介质到15ml锥形管中。离心锥形管2250 XG 5分钟。倒出介质。添加无血清的RPMI适当体积，并确认通过血细胞计数器所需的细胞密度。通过添加额外的RPMI或纺丝和在一个较小的体积 – 相应地重新悬浮调整densities-。 分装500微升的各细胞悬浮液到在冰上标记1.8毫升管中。 3.尾静脉注射拿鼠标，尾巴举行，引导它后，首先进入鼠标限制器。与在阻挡器的主腔室中的躯干，与外面的尾部，拉鼠标朝向限制器的端部。将阻挡柱塞，继续推动，直到鼠标是安全的。 旋转鼠标90度，使得侧面尾静脉中的一个被朝上。使用醇垫，大力清洁鼠标的尾部的一侧，特别是在尾静脉是最明显的。 注：良好的照明是对B57BL / 6J小鼠有效尾静脉可视化的关键。热灯或加热手术垫，而不是必须的，也将通过增加尾静脉的体积帮助。 在无菌培养罩，从200万个细胞/毫升管收集300μl的细胞培养基。反转针，弹在SIDE和推动柱塞，以从注射器排出气泡。喷射培养的RPMI以导致250微升的最终体积。 延长小鼠尾巴与非惯用手。持用非优势手的食指升高的尾部的近端，和用拇指按下尾部的远侧部分的尾部。 注意：在这种方式中，尾静脉在侧向位置上，平行于该阻挡表面上，在尾部的更远侧部分的全等条目可能。 针插入尾静脉，朝向远端，在一分钟向下的角度，首先，然后调整针以匹配在进一步插入尾静脉的角度（降低相对注射器的柱塞端的针） 。 插入针大约1cm到尾静脉。插入之后，开始推动柱塞，持针稳定。 注意：如果该针在尾静脉注射针的端部是正OT阻挠媒体应不受阻碍地流入静脉。有效喷射的特征在于从静脉血液清除。如果有阻力，或气泡开始形成在注射部位，取出针头，并在沿尾静脉更近侧位置再次尝试。 从静脉取出针并丢弃。持反对纱布入口点停止任何出血。 从阻挡器取出柱塞和将鼠标在收件人笼。 重复所有其它浓度。 注意：肺癌病灶建立大约需要2 – 3周，与取决于细胞系和灶的期望尺寸可变性9在过渡期间，小鼠应为可能保证早期安乐死，如过度喘气症状来监测。 4.计数肺灶通过在CO 2室设置并暴露于100％的CO 2安乐死鼠标</sUB>以每分钟室体积10-30％引入5分钟。用颈椎脱位跟随。 上张开泡沫塑料鼠标。用手术剪，创建沿胸骨手术切口。 使两个附加切口，无论从胸骨切口的顶部和分支朝向鼠标的肩膀上，露出了肋骨。 使两个切口，每个沿着胸骨的侧面，以从躯干移除左肋，露出了肺和心脏。 拿着手术镊子的心脏，切开食道和气管，从鼠​​标释放心脏和肺部。将解剖显微镜下，在放大10倍，以便更好地观察。 从肺解剖的心脏，取出胸腺，只留下两个肺。 随着解剖显微镜下肺，开始计数肺部病灶。每个病灶应显示为肺部的表面上的圆形，棕色obtrusion。 对于小鼠之间的一致性，计数一个波瓣的表面上灶的数目，然后反转该叶。做四个波瓣单独允许更容易计算。 保存并执行，如果IHC修复肺，否则丢弃的遗体。