حقن خلايا الفئران مسانج الميلانوما لتحديد ما إمكاناتهم الإنتقالية في الرئتين
Summary
Metastasis plays a profound role in the virulence of cancer, accounting for an estimated 90% of deaths. We report a protocol for a metastatic melanoma model in mice that is useful for determining the efficacy of therapeutic agents against this clinical phenomenon.
Abstract
Approximately 90% of human cancer deaths are linked to metastasis. Despite the prevalence and relative harm of metastasis, therapeutics for treatment or prevention are lacking. We report a method for the establishment of pulmonary metastases in mice, useful for the study of this phenomenon. Tail vein injection of B57BL/6J mice with B16-BL6 is among the most used models for melanoma metastases. Some of the circulating tumor cells establish themselves in the lungs of the mouse, creating “experimental” metastatic foci. With this model it is possible to measure the relative effects of therapeutic agents on the development of cancer metastasis. The difference in enumerated lung foci between treated and untreated mice indicates the efficacy of metastases neutralization. However, prior to the investigation of a therapeutic agent, it is necessary to determine an optimal number of injected B16-BL6 cells for the quantitative analysis of metastatic foci. Injection of too many cells may result in an overabundance of metastatic foci, impairing proper quantification and overwhelming the effects of anti-cancer therapies, while injection of too few cells will hinder the comparison between treated and controls.
Introduction
ورم خبيث هو السبب الرئيسي للوفاة بين مرضى الأورام الخبيثة. عملية نشر المنتشر من الخلايا السرطانية وغير مفهومة ولكن يبدو أن تنطوي على عدة خطوات، بما في ذلك غزو الأنسجة المجاورة، دخول الوعاء في الأوعية اللمفاوية والأوعية الدموية والبقاء والنبات ضمن نظام الدورة الدموية، والتسرب من الأوعية الدموية في موقع ورم خبيث، والتكيف لالمكروية الجديدة للموقع الجديد، والاستعمار في الموقع الجديد من خلال انتشار وتشكيل الأورام الثانوية 1. كل هذه الأحداث البيولوجية تنطوي على التحول ونشر وبقاء خلايا الورم النقيلي. على سبيل المثال، فإن التحول من النمط الظاهري الظهارية للخلية السرطانية في النمط الظاهري الوسيطة، إلى جانب التفاعل الناجح مع المصفوفة خارج الخلية، تمكنها من غزو الأنسجة المجاورة وmetastasize إلى أجزاء أخرى من الجسم. 2،3 علاوة على ذلك، فإن هذه النقيلي خلايايجب البقاء على قيد الحياة داخل مجرى الدم تعميم والتهرب من مراقبة محصنة من المضيف. 4،5 وأخيرا، عندما زرعت في موقع بعيد داخل الجسم، والخلايا السرطانية يجب أن تتكيف مع المكروية بهم من أجل التكاثر وتشكيل الأورام الثانوية. 6،7 لذلك ، على الرغم من ورم خبيث هو ظاهرة شائعة بين مرضى السرطان، وخلايا الورم النقيلي لها مجالات متعددة من الضعف التي هي قابلة للتدخل العلاجي.
ونظرا لطبيعة مناعة من سرطان الجلد، والفائدة الأخيرة في المناعية، ونماذج لسرطان الجلد مفيدة على نحو متزايد. 8 في الولايات المتحدة وحدها، سرطان الجلد هو سبب ما يقدر بنحو 9000 حالة وفاة سنويا. 9 مواقع مشتركة من ورم خبيث سرطان الجلد هي العظام والدماغ والكبد، والرئتين. غالبية الانبثاث إلى مواقع بعيدة تحدث من خلال مجرى الدم. تعميم الخلايا السرطانية في الدم يجب أن تهرب من إزالة المناعي، والوصول إلى سرير شعري من جهاز القاصي وغزو من خلال الخلايا البطانية في الأوعية الدموية من أجل إثبات وجودها بنجاح. 4-7،10، 11
لمحاكاة الظواهر الشائعة وضراوة من ورم خبيث، تم إنشاء الفئران B16-BL6 خط الخلية. والمتوفي من الوالدين C57BL / 6 خط خلية سرطان الجلد B16-F0، B16-BL6 هو المنتج النهائي من 10 اختيارات متتالية لورم خبيث في الرئة من الحقن في الوريد (مما أدى إلى B16-F10)، تليها 6 اختيارات متتالية لاختراق غشاء المثانة. 12 وعلى هذا النحو، بل هو خط خلية سرطان الجلد يمكن الاعتماد عليها لإقامة بؤر المنتشر في الماوس، وخاصة عندما تم حقنها عن طريق الوريد. 13
بعد حقن كمية كافية من B16-BL6 الخلايا في الوريد ذيل B57BL / 6 الماوس، تليها أسبوعين أو أكثر للسماح للزرع ونمو الخلايا B16 / BL6، وبؤر المنتشر يشكل في الرئتين. على القتل الرحيم والتفتيش من قبل تشريح المجهر، وعدد منفرد بؤر الحاضر يمكن أن يكون كميا. وهذا، بدوره، يمكن استخدامها لإنشاء تأثير جرعة ورم خبيث، وعدد الخلايا B16-BL6 حقن يرتبط مع عدد من البؤر تشكلت على سطح الرئتين. ويعرف هذا النموذج ب "ورم خبيث التجريبي"، حيث يتم إدخال الخلايا المعروفة النقيلي مباشرة إلى مجرى الدم، وتسهيل انتشار سريع ويمكن التنبؤ به وإنشاء في الرئتين، الكبد، أو جهاز آخر من التحقيق. هذا هو على النقيض من "ورم خبيث عفوية،" حيث يتم زرع الخلايا السرطانية، وغالبا ما تحت الجلد، والانبثاث تنشأ من إلقاء عضويا الخلايا السرطانية. 14،15
ومن المهم أن حقن كمية مناسبة من الخلايا B16 / BL6 في الأوردة ذيل الفئران. كثيرة جدا، وسيتم تغطية الرئتين مع الانبثاث وسوف البؤر المجاورة لا يمكن تمييزها عن بعضها البعض. عدد قليل جدا، وسوف تأثير عامل علاجي يكون غير مدرك بسبب الأصيل فاريبالجمع بين الحقن. من أجل الحصول على العدد الأمثل من بؤر على الرئتين من C57BL / 6 الفئران، فمن الضروري ربط عدد من حقن الخلايا مع كمية من بؤر النقيلي أنشئت على سطح الرئتين مع الأخذ بعين الاعتبار distinguishability الفردية البؤر. وهذا البروتوكول يبرهن على وجود نموذج سرطان الجلد المنتشر الفئران لC57BL / 6 الفئران.
Protocol
Representative Results
Discussion
تعميم الخلايا السرطانية من حقن الوريد الذيل تمثل الانبثاث تتهرب من المواقع النمو الابتدائي والهجرة من خلال طرق مثل مجرى الدم أو الجهاز الليمفاوي، وأحيانا وضع أنفسهم في الأسرة الشعرية من أماكن بعيدة. 14 البروتوكول المذكورة أعلاه نموذجا للمرحلة الثانوية الانبثاث. مع العدد الأمثل من الخلايا B16-BL6 حقن، ويمكن المجربون تحديد أثر النسبي للعقار تدار أو السكان الخلايا المناعية، بعد تحييد، على ورم خبيث الخلايا السرطانية.
هذا البروتوكول لديه قيود. وقد تم اختيار الخلايا السرطانية المنتشرة لقدرتها على metastasize، وبالتالي غير قابلة للمناعة، وجود مستويات أدنى من التوافق النسيجي الرئيسي من الدرجة المعقدة 1 الجزيئات. 12 وعلاوة على ذلك، وإدخال مفاجئ ومتفاوت من عدد كبير من الانبثاث هو عكس السيناريو النموذجي في المرضى حيث أعداد صغيرة من خلايا الورم النقيليتبدد على مدى فترة طويلة من الزمن من موقع الورم الرئيسي. بالإضافة إلى ذلك، فإن الخلايا السرطانية قدم عن طريق الوريد هي من زراعة الأنسجة وليس من أصل الورم الرئيسي. لذلك، وهذه الخلايا هي عكس الانبثاث الثانوية التي تنتج عن تغيرات في التصاق الخلايا، والهجرة، والاعتراف المناعة، والمتلقي إنشاء الجهاز. 15،16
ومن شأن بروتوكول بديل يكون حقن تحت الجلد B16 / BL6 لتوليد الأورام الأولية وتحليل الناتج الانبثاث الرئة "عفوية". تم العثور على هذه الانبثاث "عفوية" لاحتواء المزيد من التجانس من نظرائهم "التجريبية"، مطابقة بشكل وثيق أولئك المرضى من البشر. بروتوكول يحد في قدرتها على تحديد تأثير مركب تجريبي على ورم خبيث. مع الجانبي حقن الوريد الذيل، وعدد من خلايا سرطان الجلد حقنها في مجرى الدم ويمكن أن يقترب عبر حemocytometer. مع ورم خبيث "عفوية"، ولكن، هناك قدر أكبر من التجانس بين الأورام، إضافة متغير إضافي لعدد من الناتج بؤر الرئة. 16
في الختام، يمثل الذيل الوريد B16 BL6 نموذج سرطان الجلد الفئران نموذج بسيط لتحديد تأثير العلاج أو العلاج المناعي على ورم خبيث. عن طريق حقن الوريد تعميم الخلايا السرطانية، يمكن للباحثين تكرار، إلى حد ما، والمرضى بعد ورم خبيث. وبالنظر إلى الآثار المدمرة للخلايا الورم النقيلي في مرضى السرطان، وهذا النموذج هو أداة قوية لفهم عملية متعددة الخطوات من ورم خبيث.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
بدعم جزئي من منحة المعهد الوطني للسرطان 1R03CA172923.
Materials
| Trypsin | Corning | MT25052CV | |
| RPMI 1640 Medium | Corning | MT15040CM | |
| Phase Contraast Hemacytometer | Hausser | 02-671-54 | |
| Micro-Fine IV Insulin Syringes | BD | 14-829-1D | |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Fisherbrand | 22-363-750 | |
| Mouse Restrainer | Braintree Scientific | NC9999969 | Restrainer choice depends on age/size of mice |
| Heating Pad | Harry Schein | NC0012697 | Optional |
References
- Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331, 1559-1564 (2011).
- Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. J Clin Invest. 119 (6), 1420-1428 (2009).
- Stetler-Stevenson, W. G., Aznavoorian, S., Liotta, L. A. Tumor cell interactions with the extracellular matrix during invasion and metastasis. Annu Rev Cell Biol. 9, 541-573 (1993).
- Allard, W. J., Matera, J., Miller, M. C., et al. Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant disease. Clin Cancer Res. 10, 6897-6904 (2004).
- Dunn, G. P., Bruce, A. T., Ikeda, H., et al. Cancer immunoediting: from iimmunosurveillance to tumor escape. Nat Immunol. 3, 991-998 (2002).
- Hugo, H., Ackland, M. L., Blick, T., et al. Epithelial-mesenchymal and mesenchymal-epithelial transition in carcinoma progression. J Cell Physiol. 213, 374-383 (2007).
- Kang, Y., Massague, J. Epithelial-mesenchymal transitions: Twist in development and metastasis. Cell. 118, 277-279 (2004).
- Hodi, S. F., et al. Improved survival with Ipilimumab in patients with metastatic melanoma. NEJM. 363 (13), 711-723 (2002).
- Ekwueme, D. U., Guy, G. P., Li, C., Rim, S. H., Parelkar, P., Chen, S. C. The health burden and economic costs of cutaneous melanoma motality by race/ethnicity-United States. J. Am. Acad. Dermatol. 65, 133-143 (2011).
- Alizadeh, A. M., Shiri, S., Farsinejad, S. Metastasis review: from bench to bedside. Tumor. Bio.Volume. 35, 8483-8523 (2014).
- Weinberg, R. A. Is metastasis predetermined. Mol. Oncol. 1 (3), 263-264 (2007).
- Ishiguro, T., Nakajima, M., Naito, M., Muto, T., Tsuruo, T. Identification of genes differentially expressed in B16 murine melanoma sublines with different metastatic potentials. Cancer Res. 56 (4), 875-879 (1996).
- Clark, E. A., Todd, R. G., Lander, E. S., Hynes, R. O. Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC. Nature. 406, 532-535 (2000).
- Terranova, V. P., Hic, S., Diflorio, R. M., Lyall, R. M. Tumor cell metastasis. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 5 (2), 87-114 (1986).
- Elkin, M., Vlodavsky, I. Tail vein assay of cancer metastasis. Curr Protoc in Cell Biol. , (2001).
- Hagedorn, H. G., Bachmeier, B. E., Nerlich, A. G. Synthesis and degradation of basement membranes and extracellular matrix and their regulation by TGF-beta in invasive carcinomas (Review). Int. J. Oncol. 18 (4), 669-681 (2001).
- Hart, I. The selection and characterization of an invasive variant of the B16 melanoma. Am J Pathol. 97 (3), 587-600 (1979).
- Overwijk, W. W., Restifo, N.P. B16 as a Mouse Model for Human Melanoma. Curr Protoc Immunol. 20 (1), (2001).
