Un modello enzima e Neural Stem Cell Culture siero-libero per EMT Investigation Adatto per Drug Discovery
Summary
Epithelial to mesenchymal transition (EMT) allows cancers to become invasive. To investigate EMT, a neural stem cell (NSC)-based in vitro model devoid of serum and enzymes is described. This standardized system allows quantitative and qualitative assessment of cell migration, gene and protein expression. The model is suited for drug discovery.
Abstract
Epiteliale di transizione mesenchimale (EMT) descrive il processo dell'epitelio transdifferentiating in mesenchima. EMT è un processo fondamentale durante lo sviluppo embrionale, che comunemente si verifica nel glioblastoma, la più frequente tumore maligno al cervello. EMT è stato osservato anche in più carcinomi di fuori del cervello, tra cui il cancro al seno, il cancro del polmone, cancro del colon, cancro gastrico. EMT è legata in posizione centrale per malignità, promuovendo la migrazione, l'invasione e la formazione di metastasi. I meccanismi di EMT induzione non sono pienamente compresi. Qui si descrive un sistema in vitro per l'isolamento standardizzato di cellule corticali neurali staminali (NSC) e la successiva EMT-induzione. Questo sistema fornisce la flessibilità necessaria per utilizzare sia singole cellule o espianto. In questo sistema, ratto o topo embrionali NSC proencefalo sono coltivate in un mezzo definito, privo di siero e enzimi. Le NSC espresso Olig2 e Sox10, due fattori di trascrizione osservata in oligodendroccellule precursori yte (OPC). Utilizzando questo sistema, le interazioni tra FGF-, BMP- e TGFβ di segnalazione che coinvolge Zeb1, Zeb2, e Twist2 sono stati osservati in cui TGFβ-attivazione significativamente migliorata la migrazione delle cellule, suggerendo un sinergico / TGFβ-interazione BMP-. I risultati indicano una rete di FGF-, BMP- e TGFβ-segnalazione di essere coinvolti in induzione e mantenimento EMT. Questo sistema modello è rilevante per indagare EMT in vitro. E 'conveniente e mostra elevata riproducibilità. Permette anche per il confronto delle mescole diverse rispetto alle loro risposte migrazione (misurazione quantitativa di distanza), e high-throughput screening di composti di inibire o migliorare EMT (misurazione qualitativa). Il modello è quindi adatto per testare le librerie di droga per le sostanze che interessano EMT.
Introduction
Durante diversi stadi di sviluppo embrionale, le cellule epiteliali perdono la loro forte aderenza tra loro (ad esempio, giunzioni strette) e acquisiscono un fenotipo migratorio in un processo chiamato la transizione epitelio mesenchimale (EMT) 1. EMT è necessaria per la formazione di tipi cellulari aggiuntivi, come le cellule della cresta neurale mesenchimali, una popolazione che segrega dal neuroepitelio 2. EMT non è essenziale solo durante le fasi embrionali, ma richiesto anche nelle fasi successive della vita adulta a mantenere processi fisiologici nell'organismo adulto, come ad esempio la guarigione della ferita 3 e del sistema nervoso centrale di rigenerazione (SNC) in lesioni demielinizzanti 4.
Tumori epiteliali sono noti per riattivare EMT come un passo di iniziazione per la migrazione, invasione e metastasi, in ultima analisi, che porta alla progressione del cancro 1,3. EMT è infatti legata in posizione centrale ad una forte migrazione 1,3. I passi cellulari di conditioning, avviando, in fase e il mantenimento di EMT non sono pienamente compresi e hanno bisogno di ulteriori indagini.
Qui, viene presentato un standardizzato in vitro sistema modello EMT sulla base di NSC, con fattori di crescita definiti e media (senza siero e senza l'utilizzo di enzimi). Questo sistema modello è rilevante per gli scienziati che lavorano su EMT. Le famiglie di proteine Lumaca, Zeb e Twist hanno dimostrato di essere fondamentale per EMT, sia in fase di sviluppo e di malattia 1. La lumaca, Zeb e Twist famiglie sono anche coinvolti nel sistema presentato. Il sistema è basato su una specifica regione del proencefalo che normalmente non subisce EMT fornire un vantaggio particolare per lo studio di eventi iniziali durante EMT induzione.
Il sistema modello potrebbe potenzialmente essere applicato a studiare EMT in epiteli all'esterno del SNC, poiché induttori EMT chiave, come la chiocciola, Zeb e proteine torsione, si riscontrano anche durante EMT in sistemi tessuto fuori del SNC. Questo modello sistema permette l'isolamento standardizzato di NSC dalla corteccia in via di sviluppo per studiare le caratteristiche di cellule staminali in generale e, in particolare, EMT. Utilizzando questo sistema, abbiamo isolato le cellule staminali neurali, EMT indotta e studiato la successiva migrazione sotto l'effetto di FGF2 e BMP4. Abbiamo osservato che interagisce FGF- e BMP di segnalazione con TGFβ di segnalazione per promuovere la migrazione delle cellule, convalidando così il modello di sistema.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo studio un sistema standardizzato per EMT analisi NSC che utilizzano è descritta (riassunti nella figura supplementare 3). La standardizzazione assicura riproducibilità (Tabella 1 e 2). I NSCs sono derivati dalla corteccia di sviluppo, un tessuto che normalmente non subisce EMT. Questo è un vantaggio per l'analisi dei primi passi in EMT. Primi passi in EMT non possono essere adeguatamente studiati nelle cellule tumorali che si sono accumulati i cambiamenti genetici…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Lo studio è stato sostenuto dall'Università di Basilea Science Foundation e la National Science Foundation svizzero da una sovvenzione di MHS e AG (SNF IZLIZ3_157230). Ringraziamo: Dr. Tania Rinaldi Burkat per fornire generosamente infrastrutture; tutti i membri del gruppo Bettler per discussioni e commenti. Ringraziamo Gerhard Dorne (Leica Microsystems, Svizzera) per l'installazione professionale e competente della telecamera video Full HD MC170 (Leica Microsystems, Svizzera).
Materials
| BMP4, rhBMP4 | RnD Systems | 314-BP-01M | |
| Bovine pancreas insulin | Sigma | I1882 | |
| Boyden chamber, CytoSelect cell invasion assay | Cell Biolabs | CBA-110 | 24 well plate system |
| Cell culture dish with grid | Ibidi 500 mm dish, 35 mm | 80156 | |
| CellMask Orange | Life Technologies | C10045 | Plasma membrane dye, use at 1:1000 . |
| DAPI | LifeTechnologies | D1306 | Stock at 5mg/ml. Use at 1:10000. Cancerogenic. Appropriate protection (gloves, coat, goggles) required. |
| DMEM/F12 1:1 medium bottle | Gibco Invitrogen | 21331-020 | |
| FGF2, rhFGF2 | RnD Systems | 233-FB-01M | |
| Fibronectine, bovine | Sigma | F4759 | |
| Glutamax supplement | Gibco Invitrogen | 35050-061 | |
| Graphics software with pixel measurement feature | Fiji | fiji.sc/Fiji | version 2.0.0-rc-30/1.49s |
| HBSS media | Sigma | H9394 | |
| Human apo-Transferrin | Sigma | T1147 | Possible lung irritant. Avoid inhalation. Use appropriate protection. |
| L-glutamine | Gibco Invitrogen | 25030-024 | |
| Nestin, Mouse anti Nestin antibody | Genetex | GTX26142 | Use at 1:100, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1% |
| Olig2, Rabbit anti Olig2 antibody | Provided by Hirohide Takebayash | Personal stock | Use at 1:2000, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1% |
| Penicillin/Streptomycin/Fungizone | Gibco Invitrogen | 15240-062 | |
| Podoplanin, Mouse anti Podoplanin antibody | Acris | DM3614P | Use at 1:250, 4% PFA fixation, avoid Triton X100 |
| Poly-L-ornithine | Sigma | P3655 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | Skin and eye irritant. Appropriate protection required. |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Sox10, Rabbit anti Sox10 antibody | Millipore Chemicon | AB5774 | Use at 1:200, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1% |
| TGFb1, rhTGFb1 | RnD Systems | 240-B-010 | |
| Uncoated Petri dishes | Falcon Corning | 351029 |
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