Sviluppo di un modello di fegato Fibrotic etanolo-indotta in zebrafish per studiare progenitrici cellulo-mediata epatociti Rigenerazione
Summary
Sustained fibrosis with deposition of excessive extracellular matrix proteins leads to cirrhosis. Alcohol abuse is one of the main causes of severe liver disease. We established an ethanol-induced zebrafish fibrotic liver model to study the mechanisms and strategies of promoting hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury.
Abstract
Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading to cirrhosis with hepatocellular dysfunction. Among multiple hepatic insults, alcohol abuse can lead to significant health problems including liver failure and hepatocellular carcinoma. Nonetheless, the identity of endogenous cellular sources that regenerate hepatocytes in response to alcohol has not been properly investigated. Moreover, few studies have effectively modeled hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury. We recently reported on establishing an ethanol (EtOH)-induced fibrotic liver model in zebrafish in which hepatic progenitor cells (HPCs) gave rise to hepatocytes upon near-complete hepatocyte loss in the presence of fibrogenic stimulus. Furthermore, through chemical screens using this model, we identified multiple small molecules that enhance hepatocyte regeneration. Here we describe in detail the procedures to develop an EtOH-induced fibrotic liver model and to perform chemical screens using this model in zebrafish. This protocol will be a critical tool to delineate the molecular and cellular mechanisms of how hepatocyte regenerates in the fibrotic liver. Furthermore, these methods will facilitate potential discovery of novel therapeutic strategies for chronic liver disease in vivo.
Introduction
Nonostante la notevole capacità di rigenerazione degli epatociti 1, che sono il principale tipo di cellule parenchimali del fegato, insufficienza epatica cronica altera questa capacità, portando a cellule progenitrici epatiche (HPC) -dipendente rigenerazione 2.
Danni al fegato cronica è derivato principalmente da abuso di alcool, cronica da virus dell'epatite C (HCV) 3 e steatosi epatica non alcolica (NAFLD) 4. Si porta a fibrosi epatica sostenuta, che è associato con l'accumulo di matrice extracellulare (ECM) proteine. Accumulo ECM Persistendo distorce architettura epatica intatta formando un tessuto cicatriziale fibroso 5, successivamente, con conseguente cirrosi con alta morbilità e mortalità. Molti tentativi sono stati fatti per mitigare la risposta fibrotica soprattutto concentrandosi su inibendo citochine profibrogenic e miofibroblasti attivati 6. Quest'ultimo deriva principalmente dalle cellule stellate epatiche (HSC), le cellule non parenchimali epatiche principali responsabili della formazione della cicatrice fegato 4. Tuttavia, terapie rigenerative che stimolano fonti endogene cellulari tra cui HPC per rigenerare epatociti in presenza di insulti fibrogeniche sostenuti attendono ulteriori indagini.
Molti modelli sperimentali di fibrosi epatica sono stati descritti nei mammiferi. Iniezione ripetitiva di tetracloruro di carbonio (CCL 4) è stato ampiamente utilizzato per indurre la fibrosi epatica in murine e ratto modelli 7. In combinazione con una dieta ad alto contenuto di grassi (HF), l'alcol ha portato ad una sostanziale upregulation dell'espressione genica profibrogenic e fibrosi epatica 8. Mentre steatosi (accumulo di lipidi) risulta dall'esposizione alcol acuta, rende il fegato suscettibile di più grave danno epatico 9.
Il zebrafish, Danio rerio, è emerso come un prezioso sistema modello per lo studio dei vertebrati la rigenerazione. Anche sealtri vertebrati inferiori, come tritoni e Axolotl hanno una notevole capacità di rigenerazione, il pesce zebra ha vantaggi rispetto ad altri sistemi modello per quanto riguarda la manipolazione genetica e la visualizzazione strategie necessarie per manipolare i fattori di potenziale rigenerativo 10. Il pesce zebra rappresenta anche un modello vertebrato interessante per lo studio della malattia epatica alcolica (ALD) con la semplice aggiunta di etanolo (EtOH) per la loro acqua. L'esposizione acuta EtOH di zebrafish larvale e adulto causato steatosi epatica 11-13. Quando zebrafish adulto ha ricevuto l'esposizione prolungata EtOH, deposizione di collagene è stata osservata con up-regulation dei geni fibrosi correlati 14. Tuttavia, esiste la necessità di sviluppare modelli per studiare rigenerazione epatica in risposta ad EtOH come stimolo fibrogenico.
Recentemente, abbiamo sviluppato un modello di fegato fibrotico EtOH indotta in zebrafish 15. Abbiamo combinato un sistema di ablazione genetica specifica-epatociti con il trattamento EtOH in larvale e Adult zebrafish. Abbiamo generato due linee transgeniche, Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1 e Tg (fabp10a: mCherry-NTR) GT2, in cui E.coli nitroreduttasi (NTR) si fondono al ciano e proteina fluorescente mCherry, rispettivamente sotto il controllo dell'acido grasso specifico epatociti legame 10a proteine, fegato base (fabp10a) promotore. In questo sistema, NTR converte un metronidazolo profarmaco non tossico (MTZ) in un DNA inter-strand reticolante 16, inducendo la morte esplicita di epatociti. Utilizzando questo modello, abbiamo dimostrato che una popolazione di cellule epatiche, che sono sensibili alle segnalazione Notch, convertito in epatociti nella quasi totale assenza di epatociti e l'eccesso di ECM. Designiamo queste cellule come HPC. Inoltre, attraverso schermi chimici, abbiamo identificato piccoli attivatori molecola di segnalazione Wnt e inibitori di Notch che aumentano la rigenerazione degli epatociti nel fegato fibrotico. therefori, il nostro modello di fegato fibrotico in zebrafish rappresenta un eccellente sistema di screening chimico rispetto alla cultura- cellulare o sistema di screening dei mammiferi-based. Si tratta di un sistema in vivo con in termini di costi e benefici significativi di risparmio di tempo. Qui si descrivono le procedure dettagliate per la creazione di un modello di fegato fibrotico EtOH-indotta e per l'esecuzione di schermi chimici che utilizzano questo modello in zebrafish. Inoltre, le analisi tempo-corso sono stati effettuati per studiare come epatociti rigenerazione avviene nel fegato fibrotico. Questo protocollo fornirà uno strumento prezioso per studiare i meccanismi e le strategie per potenziare la rigenerazione degli epatociti nel fegato fibrotico.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo osservato rigenerazione degli epatociti HPC-mediata nel fegato recupero EtOH / MTZ-trattati, suggerendo che anche in presenza di notevoli quantità di proteine ECM compresi tipo fibrillare collagene, i HPCs conservano la loro competenza per rigenerare come epatociti. L'unico MTZ-trattamento non ha aumentato la deposizione di proteine ECM in modo significativo, mentre il EtOH unico trattamento non ha indotto attivazione HPC 15. Utilizzando il trattamento EtOH / MTZ combinato, siamo stat…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni dal GTEC (2.731.336 e 1.411.318), il NIH (K01DK081351), e la NSF (1.354.837) per CHS Ringraziamo Alem Giorgis per la lettura critica del manoscritto.
Materials
| Calcium sulfate hemihydrate (CaSO4) | Acros | AC385355000 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | EMD | MX0075 | |
| 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid (PIPES) | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | F79-500 | |
| Metronidazole (MTZ) | Sigma-Aldrich | M3761 | |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| 3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) tablet | Amresco | E404 | Dissolve one tablet with 100 ml distilled water |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | BP1600 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Low-melting agarose | Amresco | BP165 | |
| Stem Cell Signaling Compound Library | Selleck Chemicals | L2100 | 10mM stock in DMSO |
| ActiProbe-1K Library | Timtec | ActiProbe-1K | 10mM stock in DMSO |
| SB 415286 | Selleck Chemicals | S2729 | Dissolve with DMSO to 10mM |
| CHIR-99021 | Selleck Chemicals | S2924 | Dissolve with DMSO to 10mM |
| Anti-Collagen I antibody | Abcam | ab23730 | Use at 1:100 for immunostaining, reacts with fish |
| AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Molecular Probes | A31573 | Use at 1:200 for immunostaining |
| Mounting media (Vectorshield) | Vector Laboratories | H-1400 | |
| 100 mm petri dish | VWR | 25384-088 | |
| 24-well plate | VWR | 10062-896 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | Dumont #55 |
| Glass slide | VWR | 48312-003 | 75×25 mm |
| Cover glass | VWR | 48366-045 | 18 mm |
| Plastic wrap | Fisher Scientific | 22305654 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 1213100 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Vibrotome | Leica | VT1000 S | |
| Stereo microscope | Leica | M80 | |
| Epifluoresent microscope | Leica | M205 FA | |
| Confocol microscope | Zeiss | LSM700 |
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