Analyse des Zebrafish Kidney Development avec Time-lapse d'imagerie utilisant un microscope à dissection équipé pour sectionner optique

Toutes les expériences animales ont été effectuées selon les «Principes de soins des animaux de laboratoire», ainsi que la version actuelle de la loi allemande sur la protection des animaux. 1. Préparation du morpholino antisens (MO) Pour préparer une solution stock mM MO 3, ajouter 100 ul d'eau ultrapure stérile au MO lyophilisé (300 nmol en flacon de verre). Pour une dissolution complète, chauffer la solution mère à 65 ° C pendant 5 min. Sceller le flacon avec Parafilm et stocker la solution mère MO à la température ambiante (RT). Ne pas refroidir la solution mère MO parce que cela pourrait provoquer une association de MO avec les parois du flacon. Préparer une solution de travail 1 mM MO en diluant la solution mère MO avec de l'eau ultrapure stérile et ajouter la solution rouge 0,5% de phénol à une concentration finale de 0,05%. Pour obtenir 10 pi d'une solution de travail MO, ajouter 3,3 ul solution MO stock et 1 pl de solution de rouge de phénol 0,5% à 5,7 pi d'eau. Êtreavant la préparation d'un nouveau lot de solution de travail chauffer la solution MO stock à 65 ° C pendant 5 min. Avant utilisation, centrifuger la solution de travail MO pour empêcher l'aiguille colmatage. Par exemple, tourner 10 pl de solution mère MO à 15.000 xg pendant 5 min (RT) et de supprimer 8 pi du surnageant pour l'injection. NOTE: La perte de l' activité peut se produire dans des solutions morpholino au fil du temps 11. Pour exclure cela, on peut tester les solutions par spectrométrie UV en suivant le protocole fourni par le fabricant. Dans le cas des wt1a utilisés morpholino une efficacité réduite n'a pas été observé au cours d' une longue période de stockage (solution de travail 3 mM a été stocké plus d'un an). 2. Configuration de paires d'accouplement et la collecte des œufs fécondés L'après – midi avant la microinjection, la mise en place de cinq paires de la Tg (wt1b: GFP) de ligne, chacun dans un conteneur de reproduction équipé d'un tamis pour séparer amoviblemâles et femelles pendant la nuit. NOTE: Pour veiller à ce que suffisamment d'œufs sont disponibles pour une expérience d'injection réussie, le poisson utilisé comme paires d'accouplement doit avoir été pré-sélectionnés et évalués comme "producteurs" bons. Le lendemain matin, après que les lumières allument, mettre le mâle et la femelle ensemble au-dessus du tamis qui empêche les poissons de manger leurs oeufs. Regardez le frai. Une fois qu'une quantité d'oeufs sont prévues qui peuvent être injectés avant le stade 4 cellules est atteint à nouveau (environ 50), séparés pour les hommes de la femelle. Transférer les oeufs avec une pipette Pasteur dans une boîte de Pétri remplie d'eau de l'embryon pour un premier tour d'injection. Pour obtenir des tours supplémentaires d'œufs, placer une paire d'accouplement ensemble et séparés à plusieurs reprises. 3. Les travaux préparatoires pour microinjection REMARQUE: Effectuer les étapes 3.1 et 3.2 à l'avance. Pour préparer un plat qui contient les embryons en position pendant l'injection (plat de microinjection) insérer un gltoboggan cul à un angle de 40-45 ° dans un plat de 94 mm de Pétri remplie de liquide, transparent, pur, qualité alimentaire silicium. Retirer la lame lorsque le silicium est durci. Cela produit un sillon dans la couche de silicium. REMARQUE: Vous pouvez également utiliser 1,5-3% d'agarose au lieu de silicium et stocker le plat à 4 ° C. Générer des aiguilles d'injection de capillaires en verre avec un extracteur d'aiguille. Utiliser des capillaires qui contiennent des filaments internes. NOTE: Le filament aidera à transporter la solution MO vers la pointe de l'aiguille après le remblayage (voir 3.3). Mettre en place les paramètres appropriés sur l'extracteur d'aiguille. De bonnes aiguilles pour injection dans zebrafish devraient avoir de longues et minces conseils 12. Générer des conseils avec une longueur d'environ 10 mm et un diamètre de 1,5-2 um à leur fin. Par exemple, utiliser un extracteur d'aiguille horizontale avec les paramètres suivants: Heat = 330, Pull = 0, vitesse = 40, Temps = 100. Examiner la qualité des aiguilles sous unedissection microscope et trier ceux qui ont des conseils courts ou trop longs. NOTE: Les aiguilles avec des pointes courtes ont tendance à endommager l'embryon tout comme avec des conseils très longs et minces bend en touchant le chorion et ne pénétrer. Remblayer l'aiguille avec 2 pi de solution de travail MO en utilisant une pointe de microloader et l'insérer dans le porte-aiguille de l'appareil de microinjection. Comme les aiguilles sont fermées à l'extrémité de pointe, de générer une ouverture en pinçant retour la fin de l'aiguille avec des pincettes pointues sous le microscope de dissection. Vous pouvez également utiliser l'appareil de microinjection pour pousser doucement la pointe sur une surface rigide (par exemple. Bloc petit métal ou arrière de pincettes). Étalonner le volume d'injection en injectant la solution de travail MO dans une goutte d'huile minérale placée sur un réticule. Ajuster la durée d'injection pour la production d'un diamètre de goutte de 75 pm pour obtenir un volume d'injection d'environ 200 pl. <pclass = "jove_title"> 4. procédure microinjection Agencer les embryons au stade 1 de cellules le long de la gorge de la coupelle de micro-injection avec le pôle végétal vers la direction d'où vient l'aiguille (vers l'angle de 45 ° de la rainure). Perfore le chorion, et le jaune d'oeuf avec l'aiguille et l'injection de 200 pl de la solution de travail 1 mM MO (0,2 pmol) dans le jaune de 1- aux embryons de 2 cellules. En utilisant une pipette Pasteur avec une large ouverture, rassembler tous les embryons injectés dans une boîte de Pétri remplie d'eau de l'embryon et les incuber à 28,5 ° C. Dans l'après-midi, retirer les embryons morts à l'aide d'une pipette Pasteur avec une large ouverture et remplacer l'eau de l'embryon. 5. Préparation d'embryons pour In Vivo Imaging Le lendemain matin, remplacer l'eau des embryons avec de l'eau de l'embryon contenant 0,003% de N-phénylthiourée (PTU) pour inhiber la mélanisation. Ne pas appliquer PTU avant la fin de la gastrulation parce qu'il interferes avec le développement embryonnaire précoce. ATTENTION: PTU est toxique et tératogène. Porter des gants en tout temps et éviter l'inhalation et le contact avec la peau. Dechorionate les embryons avec des pinces acérées sous un microscope de dissection au stade de développement souhaité. Prenez le chorion avec une paire de pinces et d'essayer de saisir l'autre côté du chorion avec une deuxième paire de pinces. Retirez délicatement les pinces dans des directions opposées, sans perturber l'embryon. Anesthetize l'embryon en remplaçant l'eau d'embryons contenant PTU (0,003%) avec de l'eau de l'embryon contenant PTU (0,003%) et 0,02% Ethyl méthanesulfonate 3-aminobenzoate (Tricaine). Incluez l'embryon dans bas point de fusion d'agarose sur un μ-plat de lamelle à fond avec une grille de relocalisation de 50 um. intégration appropriée exige une certaine pratique. Préparer 1 ml aliquotes de 0,7% d'agarose dans 1,5 ml tubes de réaction et de les mettre sur un bloc chauffant à 36 ° C. Utiliser une pipette Pasteur avec une large ouverture à transfer l'embryon du μ-plat. Enlever l'eau de l'embryon en excès à l'aide d'une pipette Pasteur à pointe ultra-mince et superposer l'embryon avec agarose trempé. Alors que l'agarose est encore liquide, orienter l'embryon avec deux embouts gel chargeur dans la position souhaitée, à l'égard de la structure d'intérêt, ainsi que la distance à la grille de relocalisation. Placez la structure d'intérêt (ici les pronéphros) aussi près que possible du fond de verre (ici: dorsale vers le bas) et à proximité immédiate de la grille. Pour obtenir une qualité d'image optimale minimiser la couche d'agarose entre l'embryon et le fond de verre en plaçant la structure d'intérêt de l'embryon aussi près que possible du fond. En outre, localiser l'embryon à proximité immédiate de la grille, mais veillez à ce que la grille ne sera pas superposer avec la structure d'intérêt. Incluez 3-4 embryons dans différents u-plats chacun et utiliser celui qui est positionné le mieux. Lorsque l'agarose est assez dur pour maintenir l'attente d'embryons pour 2-3 Min et superposer l'embryon embarqué avec l'eau d'embryons contenant 0,003% PTU et 0,02% Tricaine. Décanter l'eau d'embryons excédentaires ou l'enlever à l'aide d'une pipette Pasteur à pointe ultra-mince. Fermez le couvercle du μ-plat à la position de verrouillage pour empêcher l'évaporation. NOTE: Eviter l'apparition de bulles d'air dans le μ-plat, car ils compromettraient l'enregistrement de l'image. 6. Microscopie REMARQUE: Utiliser un microscope équipé pour le sectionnement optique via un éclairage structuré. Enregistrement des images avec un logiciel contenant les modules suivants: multicanal, Z-Stack, séries chronologiques, Software Autofocus et focus Extended. Acquisition de Z-piles Inversez le μ-plat. Le fond de verre fait maintenant face vers l'objectif et le μ-plat sert de chambre d'imagerie. Basculer le curseur dans la position de grille et activer le mode d'éclairage structuré dans les commandes du logiciel. Étalonnerla mise au point de la grille pour la chaîne (s) de choix avec l'échantillon à examiner (embryon intégré) en suivant les instructions de l'assistant d'étalonnage Focus. Activer le mode d'acquisition z-Stack et mettez-le en mode centre. Concentrez dans le milieu de l'échantillon et le définir comme le plan central de la pile z- en cliquant Center. Régler la dimension de la pile en Z définissant la plage autour de la position centrale. REMARQUE: les structures de l'objet ne doivent pas être vus nettement à l'extérieur du premier et le dernier plan de la z-stack. Ajuster l'espacement entre les sections optiques. Pour une meilleure résolution z cliquez sur le bouton Optimal. Sur la base de la profondeur des objectifs de champ le logiciel établira une distance recommandée suivant le critère de Nyquist (50% de chevauchement). NOTE: Si le but pour les petites tailles de fichiers et les permis de structure, définir une taille d'espacement plus large manuellement. Réglage de petites étapes que recommandée ne fera que conduire à des fichiers plus volumineux sans augmenter plus tardinformations al. Time-lapse Imaging Ouvrez l'outil Time Series et régler l'intervalle de l'expérience des séries chronologiques. Par exemple enregistrer des images z-stack toutes les 30 min sur une période de 5 heures. Pour corriger la dérive focale au fil du temps, mettre en place une stratégie de mise au point automatique. Cochez la case de dialogue Stratégie Focus, sélectionnez Software Autofocus dans la liste déroulante et choisissez le canal TL-Brightfield comme canal de référence. Commencez chaque point de temps avec la mise au point automatique. Afin d'assurer une plage de recherche fiable dans un laps de temps optimisé, définir un fixe de 200 um par rapport plage de recherche. Cette gamme est entièrement numérisé (paramètre couverture Range) avec une qualité de base (paramètre de qualité) dans une taille maximale de l'étape (paramètre d'échantillonnage). Pour augmenter la précision de la mise au point automatique, activer le dosage dans une région de centre d'intérêt (focus ROI) et la position dudit foyer ROI dans la fenêtre de vue en direct autour de la structure d'intérêt. NOTE: Sile système n'a pas le module logiciel Autofocus qui met à jour automatiquement le z-position centrale pendant l'enregistrement time-lapse, mettre en pause l'expérience à un moment donné et d'ajuster la mise au point manuellement et continuer l'expérience. Pour compenser une xy-dérive potentielle lors de l'enregistrement des séries chronologiques, la position d'un point de la grille imprimée (de la chambre d'imagerie) notamment dans le collimateur du logiciel et enregistrer le positionnement en faisant une capture d'écran. Commencez l'expérience des séries chronologiques. Avant l'intervalle de séries temporelles est terminée, mettre en pause l'expérience et, si nécessaire, ré-ajuster le positionnement en fonction de la capture d'écran. Continuer avec l'expérience. Traitement 7. Image Passez à l'onglet de traitement et sélectionnez la Profondeur étendue de mise au point (EDF) dans la boîte de dialogue Méthode. Depuis sections optiques sont acquises, appliquer l'algorithme de projection maximale de la série d'images. NOTE: Voici l'algorithme va projeter le brightest ou le pixel le plus sombre de la pile à une image composite 2D dans une première étape et, éventuellement, utiliser l'une avec la plus haute variance comme une image de résultat pour chaque point de temps. Utilisez la méthode Film Export pour créer un film laps de temps (par exemple , avi ou déplacer le fichier) de la série d'images EDF.