Optical Monitoring van Living zenuwuiteinde Labeling in haarfollikel Lanceolate Endings van de<em> Ex Vivo</em> Mouse Ear Skin

Deze werkwijzen werden gebruikt in de gerapporteerde Banks onderzoek, RW et al. 2 muizen werden humane geëuthanaseerd door cervicale dislocatie. In het Verenigd Koninkrijk is dit een wettelijk goedgekeurde Schedule 1 methode in de Dieren (Scientific Procedures) vermeld Act, 1986 en de Europese Richtlijn 2010/63 / EU. Deze federale wetgeving wordt lokaal afgedwongen bij de Universiteit van Aberdeen door de Animal Welfare en Ethical Review Board, die alle procedures hebben goedgekeurd. 1. Voorbereiding Ears voor Labeling Bereid een standaard fysiologische zoutoplossing, zoals Liley's (1956) 5 en verzadigd is met 90% O2 / 5% CO 2 (carbogen). Liley's zoutoplossing (mM) NaHCO3 (12), KCl (4), KH 2PO 4 (1), NaCl (138,8), MgCl2 (1), CaCl2 (2) en glucose (11). OPMERKING: Gedurende de rest van dit manuscript "saline" zal verwijzen zoutoplossing die volledig is verzadigd met carbogeen. tijdens dissection, vernieuw de zoutoplossing voor het voorbereiden om de 15 – 20 min. Humaan euthanaseren een volwassen muis zonder beschadiging van de schedel. LET OP: We hebben gebruikt C57 / Bl6J en MF1 muizen, maar elke muis stam kan worden gebruikt. Het belangrijkste aspect is groot volwassenen (> 25 g) te gebruiken. Labeling in grotere muizen is minder betrouwbaar, vaak wordt beperkt tot kleine en verspreide groepen van follikels. Verwijder de externe oren (oorschelpen) in de buurt van de basis met ~ 25 cm schaar, net boven de dichte haar lijn, en onderdompelen in een zoutoplossing in een siliconen-rubber bekleed cultuur / petrischaal (50 mm is meestal handig). Plaats de oorschelp anterior (holle) naar beneden en speld de marges aan de siliconen regelmatig met fijne insect pinnen (~ 6-8 per oor, ~ 0,2 mm diameter pinnen). Vernieuwen zoutoplossing elke 15 – 20 minuten, of gebruik een constant geperfundeerd bad. Verwijder voorzichtig weg het achterste vel van de voorste huid door stompe dissectie, in eerste instantie de toegang van de snede basis van de oorschelp voorbijde dikke centrale kraakbeen en systematisch werken aan de dunne, kraakbeen-vrije externe marges. Hiertoe houdt het centrum van de snijrand van het achterste vel met een paar niet. 3 forceps. Dan, met de kaken gesloten, plaats de punten van een andere set van niet. 3 forceps in de ruimte tussen de huid en de onderliggende kraakbeen. Voorzichtig werken met betrekking tot de gesloten tang van links naar rechts in de opening, met de minimale vereiste kracht, voorzichtig los verklevingen terwijl afpellen van het achterste vel om de lagen te scheiden. Met het achterste huid verwijderd, laat de voorste huid op zijn plaats. Speld de achterste huid, de huid naar boven, naast de voorste huid (volgens 1.5, hierboven). Vervolgens zorgvuldig en volledig verwijderen van de oorschelp kraakbeen dat is ingeklemd tussen de huidlagen van de voorste huid door dezelfde stompe dissectie techniek als in 1.6. Maak geen gaatjes met de tang. Vervolgens, fof beide oorschelp huid voorbereidingen zachtjes schil, pluk en wrijf weg de dunne laag van bindweefsel, die lijkt op geëxpandeerd polystyreenschuim, dat de haarfollikel bases dekt. NB: Het verkrijgen van een optimale clearing kan een beetje oefening nemen; onvoldoende weefselverwijdering hindert toegang, zowel kleurstofoplossing en beeldvorming, terwijl schrapen te krachtig verwijdert de neurale netwerken die aan de basis van de follikels. Vernieuw de zoutoplossing. 2. Lanceolate Terminal Labeling Opmerking: Het volgende protocol is geoptimaliseerd voor styryl pyridinium kleurstof. Andere, chemisch vergelijkbaar, styryl pyridinium kleurstoffen moeten werken, misschien na enige aanpassing in de concentratie en de incubatietijd. Draag handschoenen en een laboratoriumjas bij het hanteren van kleurstof oplossingen. Ofwel koopt 10 mM voorraad kleurstofoplossing rechtstreeks van de fabrikant of voor te bereiden voorraad door het oplossen van de kleurstof poeder in een zoutoplossing zonder glucose. Monster (10 ui is meestal handig, maar passen dit voor grote scale experimenten) en opslag ingevroren voor maximaal 6 maanden bij -20 ° C of ~ 1 jaar bij -80 ° C. Poeder worden opgeslagen gedurende ten minste 2 jaar. Vermijd herhaalde vries / dooi cycli van kleurstof-oplossingen; deze snel denatureert de kleurstof. Eenmaal ontdooid, bewaren bij 4 ° C en gebruik binnen 1 week. Verwarm een ​​waterbad tot 30 ° C, met een platform ~ 3-5 mm onder het oppervlak van het water. Vers bereid 10 uM styryl pyridinium kleurstofoplossing (10 ui vers ontdooide 10 mM styryl pyridinium kleurstof in 10 ml zoutoplossing) en equilibreren waterbad. Pin elke bereiding in een siliconen-rubber bekleed 35 mm cultuur gerechten ondergedompeld in 1-2 mm van een zoutoplossing (typisch volume ~ 2 ml). Elke oorschelp huid voorbereiding zal twee bereidingen opleveren als in tweeën gesneden van apex naar de basis met een klein schaartje (10 – 15 cm lengte), om het gebruik van dieren zoveel mogelijk te beperken. Plaats de 35 mm schaaltjes met de met zoutoplossing behandelde pinna preparaten in de ondergedompeld platform in het 30 ° C waterbad. Zorg ervoor dat dewaterdiepte voldoende is voor een adequate opwarming, maar niet het zoute verontreinigen in de open schotel. Pin prima (0,5-1 mm buitendiameter) buis met vloeiende O 2 / CO 2 in de siliconen basis van elk gerecht om continu gas de voorbereidingen. Ook te plaatsen in het waterbad van 100 ml van de kleurstof-free zoutoplossing voor het wassen / schotel verfrissend. Gebruik een goed afgesloten fles om carbogen verzadiging behouden en waterverontreiniging te voorkomen. Evenwicht alles bij 30 ° C gedurende 30 minuten en plaats de zoutoplossing over de oorschelp voorbereidingen van het 100 ml afgesloten fles. Incubeer nog eens 30 minuten. LET OP: Deze vervanging compenseert voor zout verdamping en eventuele bulk volume verliezen als gevolg van gas-lijn borrelen. Giet weg dye-vrije zoutoplossing in een 100 ml afval beker, dan snel en voorzichtig dep weg eventuele resterende rond de voorbereiding met papieren zakdoekje vloeistof tot een minimum te beperken verwatering effecten op de kleurstof oplossing naast worden toegevoegd. Neem zorg niet aan te raken ( <em> dwz schade) de blootgestelde diepe huid oppervlakken direct. Incubeer pinna preparaten in 2-3 ml 10 pM styryl pyridinium kleurstof gedurende 40 minuten bij 30 ° C dan terug naar R / T voor de rest van de procedure. Verwijder niet-geïnternaliseerde kleurstof in drie fasen via oplossingen bij R / T. LET OP: Deze stappen zijn het best uitgevoerd in een mum van omgevingslicht (verduisterende rolgordijnen, rood / oranje lage intensiteit verlichting) om te beginnen met het oog dark-aanpassing voor de beeldvorming. Giet weg de etikettering oplossing uit de gerechten in een verspilling beker en snel te spoelen in drie veranderingen van de dye-vrije zoutoplossing in hoog tempo op. Dit verwijdert de resterende styryl pyridinium kleurstof oplossing vast te houden aan de voorbereidingen en elke kleurstof die gemakkelijk departitions uit blootgesteld membranen. Incubeer in een verandering kleurstof-zoutoplossing gedurende nog eens 30 min meeste resterende kleurstof departition oppervlak van membranen, dat wil zeggen, kleurstof niet geïnternaliseerd door de terminals. Verwijder hardnekkige kleurstof vast to de externe bijsluiter van blootgestelde membranen door chelerende met gesulfoneerde b-cyclodextrinederivaat (Advasep-7, 1 mM, 5 min – zie tabel 1). Zo zullen alle resterende kleurstof in het weefsel. Plaats in verse kleurstofvrije zoutoplossing beeldvorming en de buitenkant van de schaal drogen met tissue papier. OPMERKING: De klemmen zijn nu klaar voor beeldvorming. Het is belangrijk om te beseffen dat de lanceolate eindes zijn in leven en dus weer langzaam het vrijgeven van de endocytosed styryl pyridinium kleurstof. Hoewel trager bij R / T zal zijn, is het belangrijk om vertragingen voor / minimaliseren tijdens de beeldvorming. Indien het experiment kenmerken van verschillende preparaten vereist, aanvankelijk behouden ze allemaal unlabeled bij 30 ° C. Zij levensvatbaar gedurende enkele uren. label vervolgens achtereenvolgens met tussenpozen, door het labelen van de tweede opstelling (stappen 2.7 – 2.8.3), terwijl het afbeelden van de eerste. 3. Imaging gelabelde Lanceolate Endings. LET OP: De waarnemermoet donker aangepast voor de volgende beeldvormende stappen. De verhoogde gezichtsscherpte dit levert betekent lagere excitatielicht niveaus moeten de follikels voor beeldvorming vinden. Dit is heel belangrijk voor het minimaliseren fototoxiciteit plaats van het verminderen van het ongemak van fotobleken. Vrije radicalen gegenereerd door volle intensiteit verlichting kan snel (binnen 60 sec) te doden wonen zenuwuiteinden (GS Bewick, S. Fadul en WJ Betz, ongepubliceerde waarnemingen). Voor de beeldvorming, controleer dan de voorbereiding onder een dissectie stereomicroscoop en verwijder voorzichtig elk oppervlak puin. Dit voorkomt auto-fluorescentie besmetting van de beelden. Plaats de schotel op het podium van een rechtopstaande epifluorescentie microscoop met een standaard fluoresceïne filter set (480-488 nm excitatie, 500-520 nm emissie voor styryl pyridinium kleurstof). Verzwakken de excitatie lichtintensiteit met neutrale dichtheid filters tot net genoeg om comfortabel te lokaliseren van de terminals. Lokaliseren gelabeld follikels door het observeren met een lage (3.5x – 4x droog objectief), dan steeds hogere (10x en 20x water immersie objectief) vergroting doelstellingen. Maak foto's van gelabeld lanceolate terminals tot 10x droog doelstelling voor laag vermogen en 20x water immersie doelstellingen voor een hogere vergroting. Minimaliseren van de lichtintensiteit en belichtingstijd (een camera integratie tijd van 0,5-1 sec wordt gesuggereerd). Maak foto's op een standaard digitale camera's en beelden op de computer van de harde schijf op te slaan met behulp van propriëtaire software. OPMERKING: Een typisch voorbeeld wordt getoond in figuur 1. Afbeelding ~ 20 lanceolate eindes van elk preparaat. Vanaf de rand het verst van de snijrand aan de basis van de oorschelp huid en werken langs deze rand beeldvorming elke follikel beurt. Werk aan de overkant in een iets overlappende gebieden evenwijdig aan de snijkant, zorg ervoor dat het imago van de dezelfde follikel twee keer en iemand die duidelijk beschadigd. LET OP: Dere zijn meestal te veel lanceolate terminals op de foto om ze allemaal voordat belangrijke spontane de-kleuring optreedt. Zo raden we systematisch bemonsteren van de bevolking met behulp van het volgende protocol. Na de marginale strook, beweegt één veld breedte naar de basis van de oorschelp en gaat in de omgekeerde richting. Afbeelding alle terminals ondervonden, behalve af en toe die duidelijk gericht heel veel meer schuin naar de optische vliegtuig en waarschijnlijk niet volledig passen binnen de standaard ringvormige analyse ROI (zie paragraaf 4). Sluiten niet uit ongewoon helderder of dimmer lanceolates in vergelijking met de omliggende terminals, tenzij ze zijn duidelijk beschadigd is of de achtergrond intensiteit is bijzonder hoog, wat aangeeft plaatselijke weefselschade. Gooi de bereiding als meer dan 10% van het huidgebied / aansluitingen beschadigd / onbruikbaar. OPMERKING: lanceolates Destain tijd, volledige beeldvorming elk preparaat binnen 20 min na het einde van de was. ikf het gebruik van meer dan één preparaat, zorgen voor intensiteit vergelijkingen zijn geldig op de tijd die overeenkomen met de voorbereidingen. Om dit te doen, offset timings van kleuring elk preparaat door ~ 30 min, om de vergelijkbaarheid van de-vlek keer te verzekeren. Om de-vlek (exocytose), image dezelfde terminal te bewaken op 5 of 10 minuten intervallen. Met de praktijk is het mogelijk om het tot 3 afzonderlijke terminals op elk tijdstip één preparaat. 4. Analyseren gelabelde Lanceolate Endings. Opmerking: De volgende procedure is een snelle werkwijze voor het analyseren terminal intensiteit. Maak een ringvormig gebied van belang (ROI) gecentreerd op het uiteinde van de haarschacht aan de basis van de follikel (figuur 2). Stel de binnenomtrek van de ringvormige ROI groot genoeg om de haarschacht auto-fluorescentie in elke follikel voorkomen worden geanalyseerd maar omvatten alle terminal fluorescentie. Zorg ervoor dat de buitenste omtrek is groot genoeg om de grootste termin omsluitenal waarschijnlijk zal worden geconfronteerd, dat gericht is dicht bij de belangrijkste optische / follikel as. Wordt achtergrond ROI ongeveer even vlak voor het doel annulus (vierkant of cirkel, typisch ~ 400 um 2) aan de lokale kleurintensiteit in de nabijheid van de terminal die geanalyseerd bepalen. Opmerking: De afmetingen van deze twee ROI worden aan het begin van de analyse en alle daaropvolgende follikels / lancetvormige terminals in alle preparaten analyseren per experiment. Het is dus belangrijk om hun parameters zorgvuldig aan het begin. Plaats de achtergrond ROI dicht genoeg bij de follikel aan de lokale achtergrond in de talgklieren dat de terminals, niet de lagere intensiteit huid tussen de follikels ten grondslag liggen te vertegenwoordigen, maar wees voorzichtig om geen terminale gebieden omvatten. Noteer de gemiddelde intensiteit van de twee ROI gebruiken "actie" of "analyse ROI 'functie van de software en gegevensoverdracht naar een spreadsheet. In de spreadsheet, voor elk follikel aftrekken van de gemiddelde achtergrond plaatselijke intensiteit van die in de annulus om een ​​netto-intensiteit geven. Deze aanpassing voor gelokaliseerde achtergrond vermindert tussen follikel variabiliteit.