Seguimiento óptico del nervio terminal de estar etiquetado en folículo piloso lanceoladas Los finales de la<em> Ex Vivo</em> Piel de la oreja de ratón
Summary
Here we describe a novel preparation for imaging live lanceolate sensory terminals of palisade endings that innervate mouse ear skin hair follicles during staining and destaining with styryl pyridinium dyes.
Abstract
Una nueva técnica de disección y grabación se describe para la tinción de control óptico y de-tinción de terminales lanceoladas que rodean los folículos pilosos en la piel del pabellón de la oreja del ratón. La preparación es simple y relativamente rápido, produciendo de forma fiable extensas regiones de múltiples unidades marcadas de terminales nerviosas vivas para estudiar la absorción y liberación de colorantes de piridinio estirilo se utilizan ampliamente en los estudios de reciclaje de vesículas. La subdivisión de las preparaciones antes de su etiquetado permite prueba vs. comparaciones de control en el mismo oído de un solo individuo. consejos útiles se dan para mejorar la calidad de la preparación, el etiquetado y los parámetros de imagen. Este nuevo sistema es adecuado para ensayar farmacológicamente y la absorción y liberación de estos colorantes vitales en terminales lanceoladas en tanto de tipo salvaje y los animales modificados genéticamente inducida mecánicamente. Se dan ejemplos de influencias moduladores sobre la intensidad de etiquetado.
Introduction
Terminaciones nerviosas mecanosensorial son típicamente pequeños, difusamente distribuida y de difícil acceso in situ, ya que suelen ser enterrados profundamente en la piel u otros tejidos circundantes. Visualizarlas, por lo tanto, por lo general requiere de seccionamiento seguido de un prolongado immunolabeling / período de tinción, o la demora y el costo de la obtención de líneas de ratones con la expresión genética de los marcadores fluorescentes como la proteína fluorescente verde o amarillo (GFP / YFP) 1. Aquí mostramos un tejido cómodo y un método rápido y sencillo para acceder a un gran número de fibras aferentes del folículo piloso para el estudio, y la forma en que se pueden etiquetar de forma rápida para la supervisión óptica de la función del terminal 2. Con la práctica, toda la técnica de disección para formación de imágenes se puede completar en tan sólo 2 horas.
Los terminales lanceoladas de los axones sensoriales que inervan los folículos del pelo en los mamíferos forman empalizadas de todo el epitelio del folículo piloso, con cadaterminal de intercalado entre células / Schwann glial procesa 2-4. El propósito de los terminales es para detectar el desplazamiento mecánico de los pelos que rodean. Son una mezcla de terminaciones de adaptación rápida y poco a poco, pero predominantemente producen pequeños momentos de actividad en respuesta al movimiento del cabello. Típicamente, el disparo se detiene muy rápidamente cuando el movimiento cesa, incluso en presencia de desplazamiento continuo.
Este modelo murino para el estudio de pinna terminales lanceoladas por métodos ópticos tiene muchas características ventajosas para el estudio de la estructura y función de estas terminaciones. El pabellón auricular es predominantemente dos capas de la piel yuxtapuestas espalda con espalda, con sólo una pequeña cantidad de tejido de cartílago entre. La piel es muy delgada y fácilmente diseccionado debido a cantidades mínimas de tejido conectivo débilmente adhesiva con relación a otras regiones del cuerpo. Las capas de la piel fácilmente separados, por lo tanto, dan un buen acceso a los folículos y terminales. La inervaciónes fácilmente accesible e identificable. Los folículos pilosos se distribuyen de manera más dispersa que en otras regiones de la piel, lo que facilita la obtención de imágenes de individuos o pequeños grupos de folículos. La delgada capa dérmica subyacente da una buena accesibilidad a los tintes y drogas farmacológicas, lo que es ideal para la formación de imágenes por microscopía de fluorescencia sin procesamiento adicional. La proyección de imagen de los terminales etiquetados puede ser o bien de los terminales que viven o, si se utiliza un análogo de tinte corregible, después de la fijación y posterior procesamiento histológico.
Hemos utilizado esta preparación de membrana para demostrar que el reciclaje se produce en las terminaciones lanceoladas, evidenciado por absorción (endocitosis) y liberación (exocitosis) de un colorante de estirilo piridinio (FM1-43; N – (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutilamino) estiril) piridinio dibromuro). El colorante no significa, sin embargo, parece que la etiqueta significativamente los procesos de la célula de Schwann invertir 2. También puso de manifiesto que esta absorción de colorante / liberación, y por lo tanto de membrana reCycling, está sujeto a la modulación glutamatérgica a través de una atípica (fosfolipasa D acoplados a) receptor de glutamato metabotrópico. Los resultados de los protocolos de estimulación y análisis simples se ilustran, y también se reseñan los problemas comunes de análisis posibles.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bewick y Betz desarrolló originalmente la N- (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutilamino) estiril) relacionado dibromuro-piridinio colorantes estirilo piridinio 7-10 para supervisar local de reciclaje de membrana de la vesícula sináptica. la absorción de colorante, y por lo tanto el aumento de la fluorescencia, por lo tanto, refleja la internalización de la membrana de las vesículas sinápticas (endocitosis). Posteriormente, este colorante internalizado puede ser re-lanzado por una mayor actividad eléctrica, que muestra la pérdida de tinte supervisa externalización membrana de la vesícula (exocitosis). En la sinapsis, esto es un indicador de la secreción de neurotransmisores. Al mismo tiempo, también encontramos estos colorantes etiquetan terminaciones nerviosas primarias mechanosensory 7. 11 Más recientemente, Bewick, Banks y sus colegas mostraron entonces que esto refleja un proceso similar en terminales mechanosensory maduras y diferenciadas ex vivo. Una vez más, los tintes etiquetan 50 de diámetro vesículas sinápticas 'similar' nm (SLV) que reciclan de forma constitutiva de la liberación de glutamato.En terminales mechanosensory, a diferencia de sus homólogos sinápticas, este reciclaje es principalmente espontánea. También es modulada por mecánica, en lugar de simplemente eléctrica, la estimulación.
Para neuronas sensoriales en la cultura y en las células ciliadas cocleares, tintes de estirilo en tinte general y estirilo piridinio, en particular, se ha demostrado que pasar a través de los canales mechanosensory, el bloqueo de los canales mechanosensory e irreversiblemente el etiquetado de las membranas internas 12. Sin embargo, en concentraciones de colorante estiril comparables en terminales mechanosensory diferenciados en situ, como aquí en terminaciones lanceoladas 2, o en las terminaciones Ia en los husos musculares 11, y en células de pelo que no son estimuladas mecánicamente 13, 14, el etiquetado es por endocitosis membrana. En las terminales nerviosas mechanosensory, por ejemplo, el etiquetado es reversible y no bloquea las respuestas mechanosensory en las concentraciones utilizadas aquí 2, 11, 15. Si bien algunos internalización de tinte a la permeabilidad del canal en estas terminaciones no se puede descartar por completo, el destain casi total con latrotoxina indica la gran mayoría del etiquetado en los terminales maduros es por la internalización de la membrana reciclaje de vesículas. Tenemos, por lo tanto, se utiliza esta técnica para estudiar la dependencia de la actividad 11 y, más recientemente, la farmacología 2 de SLV reciclaje en los terminales aferentes mechanosensory mediante el examen de efectos del fármaco sobre la absorción y liberación de los colorantes.
Al igual que con la mayoría de las técnicas prácticas, reproducibilidad requiere repetición y la práctica. Algunos de los puntos clave para garantizar la fiabilidad se discutirá ahora. lanceoladas etiquetado en los animales más jóvenes es más fiable – el animal más pequeño que hemos usado fue 15 g de peso corporal. No está del todo claro por qué este es el caso, pero puede ser debido a la disección del tejido conectivo más joven requiere menos trauma mecánico y leaves menos residuo que queda cuando la eliminación de los tejidos que recubren la capa de inervación.
En general, la preparación del tejido es bastante simple, con peeling las capas de piel, aparte de ser el aspecto práctico más técnicamente difícil y sólo en los ratones más viejos. En estos, las capas de piel se adhieren fuertemente entre sí en la base donde se inicia la disección, pero incluso en este caso la separación de las capas se vuelve mucho más fácil hacia los márgenes. Afortunadamente, o tal vez en consecuencia, estas áreas de la piel marginales más delgadas suelen dar el etiquetado más satisfactoria, como lo hace la piel anterior generalmente. Por lo tanto, sobre todo evitar agarrar la piel muy delgada en los márgenes. Para reducir al mínimo el riesgo de daños, manipular preparados indirectamente, empujando con pinzas cerradas en vez de agarrar directamente, o si GRASP esencial tejidos más resistentes solamente con pocas probabilidades de ser etiquetados. Sea cuidadoso en la eliminación de la capa de 'hoja de poliestireno' que cubre inmediatamente los folículos, ya que es la principal meobstrucción mecá- de formación de imágenes y acceso a los medicamentos. Sin embargo, es esencial para minimizar el contacto físico con las estructuras subyacentes como esto daña (es decir, las tiras de distancia) las redes neuronales y terminales justo debajo. Si la fluorescencia predominante es el amarillo / blanco en las glándulas sebáceas, prominente autofluorescencia de las bases del tallo piloso y unos crecientes de las terminaciones lanceoladas de color naranja / amarillo, esto indica que la capa plexo nervioso y terminales lanceoladas asociados se han eliminado durante el despacho. Este parece ser el principal problema con el (> 30 g) los ratones más viejos. A lo largo de los procedimientos de tinción, asegurarse de que todo esté a 30 ° C y bien oxigenada. Tenga en cuenta que los terminales etiquetados todavía están vivos. En consecuencia, el tinte será secretada por la liberación espontánea exocytic en curso (constitutivo). Esto será más lento a R / T, pero es una buena práctica para reducir al mínimo el retraso entre la eliminación de la solución de agente quelante y de formación de imágenes, para minimizar la pérdida de tinte. Por otra parte, para entre-grupos comparativos sos estudios de intensidad, es esencial para asegurar la formación de imágenes de todos los grupos es el tiempo combinado. El uso de un agente colorante quelante antes de la imagen mejora en gran medida el contraste de imagen. Así, mientras que relativamente caro, la etapa de quelación es muy importante para garantizar una buena calidad de imagen. uso quelante puede ser minimizado mediante la reutilización de la solución varias veces, e incluso en 2 – 3 días consecutivos, si se almacena a 4 ° C entre usos. Desechar la solución quelante una vez que se va notablemente rosa, mostrando su secuestro de tinte se aproxima saturación.
Durante una imagen, tenga en cuenta el potencial de daño fototóxico a estos terminales que viven, que es el resultado acumulativo de la intensidad y el tiempo de exposición de la luz de excitación. Esta consideración es menos importante para las imágenes solo punto de tiempo, donde la calidad de imagen es la principal preocupación. Sin embargo, es crucial durante la exposición repetida en estudios de cinética para reducir la exposición a la luz de excitación a un mínimo. Durante el desarrollo de estos colorantes asinapsis de la etiqueta, que encontraron la excitación durante> 1 min a plena potencia luminosa de excitación provocará daños dramática e irreparable a los terminales nerviosas. Se primera posteriormente se expanden enormemente, a continuación, se colapsan por completo durante un periodo de ~ 15 min. No hemos probado de forma sistemática las contribuciones relativas de tiempo de exposición y la intensidad, pero estas observaciones sugieren el principio rector debe ser reducir al mínimo tanto. Por lo tanto, se recomienda que la intensidad de la luz de excitación y la duración son el mínimo proporcional a obtener buenas imágenes, y las imágenes apropiadas de control se toman en los estudios de tiempo-por supuesto. Para probar que los datos no se ven afectados por la fototoxicidad en condiciones de formación de imágenes repetidas, en cada punto de tiempo de tomar una imagen adicional de un terminal previamente no visto. Esto es para asegurar el comportamiento de la etiqueta en terminales ingenuos se asemeja a la de los folículos está formando la imagen de forma repetida.
Una serie de factores puede reducir la variabilidad dentro del grupo de la intensidad neta dATA. La colocación precisa de las regiones de interés, en particular la ROI fondo, es importante, ya que incluso pequeñas áreas de tinción apropiado pueden afectar en gran medida la variabilidad de datos entre-folículo. La variabilidad de la intensidad neta también se ve influida por la forma completamente cada folículo piloso está rodeado por la empalizada de terminaciones. Compárese, por ejemplo, la forma de media luna de distribución de etiquetado en la figura 1B con el patrón casi completamente circular visto en la Figura 2. Un análisis más complejo, tal vez mediante la detección de software automatizado y de umbral, son necesarios si el grado de cerco es un parámetro relevante. Tenga en cuenta que las distribuciones de intensidad, incluso para los grupos analizados con precisión la mayoría de los folículos no se distribuyen normalmente (ver Figura 3), haciendo necesario el uso de las estadísticas no paramétricas para las comparaciones entre los tratamientos de las medianas de población que en los medios. técnicas de normalización, tales como expresar intensidades como porcentaje of de control contralateral, o de un grupo de control formado por varias preparaciones, se puede aplicar para reducir aún más la variabilidad. El elemento técnico final a considerar es el diseño experimental para los ensayos farmacológicos. Durante las investigaciones farmacológicas, pre-incubar la preparación en solución de fármaco durante 30 min antes de la aplicación del tinte. A continuación, mantener la concentración de fármaco en la solución de colorante. En los controles, usar solución salina o, si el fármaco se disuelve en un vehículo, solución salina más vehículo.
El presente artículo muestra cómo esta nueva preparación pabellón auricular ofrece imágenes de alta calidad de las terminaciones mecanosensoriales en la piel con un mínimo de preparación. También mostramos que puede ser utilizado para examinar la farmacología de los dos aspectos críticos de reciclaje de vesículas. Se demuestra en primer lugar que un agonista del receptor de glutamato puede aumentar la internalización de colorante (un marcador de la endocitosis), y en segundo lugar, que el tinte se pierde de nuevo con latrotoxina (un estimulante de la exocitosis). La importancia de este preparationes y la técnica es que ofrece un excelente acceso a los terminales mechanosenory vivas de la piel sobre el terreno durante los experimentos de imagen, ofreciendo oportunidades únicas para la supervisión óptica de la función del terminal, la estructura y las relaciones entre ellos. Para este último fin, también hemos desarrollado aún más para su uso en estudios combinados ópticos / electrofisiológicos (véase el artículo de la hermana JoVe para más detalles).
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El trabajo fue financiado por el Consejo de Investigación Médica del Reino Unido G0601253 subvención para el proyecto de GSB y RSF y una subvención sulsa Bioskape de GSB
Materials
| PDMS – Sylgard 184 | Dow Corning | Flexible, inert, translucent solid silicone polymer. | |
| No. 3 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Austerlitz Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Very fine pins to attach pinna preparation securely to the PDMS with minimal damage. |
| FM1-43/Synaptogreen C4 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70020 | Fluorescent membrane probe that reversibly partitions into the outer leaflet of cell membranes. Used predominantly for monitoring vesicle membrane endo-/exocytosis. |
| Advasep 7 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70029 | A sulfonated b-cyclodextrin derivative that chelates FM1-43 (& other styryl pyridinium dyes) out of the exposed membranes, leaving internalised dye to be seen more clearly by lowering the background labelling/fluorescence. |
| Retiga Exi Fast 1394 | Qimaging | Monochrome, cooled CCD camera – basic model | |
| Volocity 3D Image Analysis Software | Perkin Elmer | Volocity 6.3 | Image capture and analysis software. |
References
- Li, L., et al. The functional organization of cutaneous low-threshold mechanosensory neurons. Cell. 147 (7), 1615-1627 (2011).
- Banks, R. W., et al. Glutamatergic modulation of synaptic-like vesicle recycling in mechanosensory lanceolate nerve terminals of mammalian hair follicles. J. Physiol. 591 (10), 2523-2540 (2013).
- Andres, K. H. On the microstructure of receptors on sinus hair. Z. Zellforsch. Mikrosk. Anat. 75, 339-365 (1966).
- Shenton, F., Bewick, G. S., Banks, R. W. A study of the expression of small conductance calcium-activated potassium channels (SK1-3) in sensory endings of muscle spindles and lanceolate endings of hair follicles in the rat. PLoS One. 9, e107073 (2014).
- Liley, A. W. An investigation of spontaneous activity at the neuromuscular junction of the rat. J. Physiol. 132 (3), 650-666 (1956).
- Suzuki, M., Ebara, S., Koike, T., Tonomura, S., Kumamoto, K. How many hair follicles are innervated by one afferent axon? A confocal microscopic analysis of palisade endings in the auricular skin of thy1-YFP transgenic mouse. Proc. Jpn. Acad. Ser. B. Phys. Biol. Sci. 88 (10), 583-595 (2012).
- Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. J. Neurosci. 12 (2), 363-375 (1992).
- Betz, W. J., Bewick, G. S., Ridge, R. M. Intracellular movements of fluorescently labeled synaptic vesicles in frog motor nerve terminals during nerve stimulation. Neuron. 9 (5), 805-813 (1992).
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255 (5041), 200-203 (1992).
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical monitoring of transmitter release and synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. J. Physiol. 460 (1), 287-309 (1993).
- Bewick, G. S., Reid, B., Richardson, C., Banks, R. W. Autogenic modulation of mechanoreceptor excitability by glutamate release from synaptic-like vesicles: evidence from the rat muscle spindle primary sensory ending. J. Physiol. 562 (2), 381-394 (2005).
- Drew, L., Wood, J. FM1-43 is a permeant blocker of mechanosensitive ion channels in sensory neurons and inhibits behavioural responses to mechanical stimuli. Molecular Pain. 3, (2007).
- Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. FM1-43 reveals membrane recycling in adult inner hair cells of the mammalian cochlea. J. Neurosci. 22 (10), 3939-3952 (2002).
- Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. Apical endocytosis in outer hair cells of the mammalian cochlea. Eur. J. Neurosci. 20 (1), 41-50 (2004).
- Watson, S., Aryiku, C., Banks, R. W., Bewick, G. S. Comparison of gadolinium and FM1-43 as blockers of stretch-evoked firing of rat muscle spindle afferents. Proc. Physiol. Soc. 21, P22 (2010).
