의 헤어 난포 피침 엔딩에서 생활 신경 터미널 라벨의 광학 모니터링<em> 전의 VIVO</em> 마우스 귀 피부
Summary
Here we describe a novel preparation for imaging live lanceolate sensory terminals of palisade endings that innervate mouse ear skin hair follicles during staining and destaining with styryl pyridinium dyes.
Abstract
신규 해부 및 녹화 기술은 광 모니터링 염색 및 마우스 귓바퀴의 피부에 모낭을 둘러싼 피침 형 단말기의 탈 염색에 대해 설명한다. 준비는 안정적으로 광범위하게 소포 재활용의 연구에 사용 스티 릴 피리 디늄 염료의 흡수와 방출을 연구하는 신경 터미널 생활의 여러 레이블 단위의 광범위한 영역을 산출 간단하고 상대적으로 빠르다. 표시하기 전에 준비를 세분화하는 것은 한 개인에서 같은 귀에 제어 비교 비교 테스트를 할 수 있습니다. 유용한 정보는 제조, 라벨 및 촬영 파라미터의 품질을 개선하기 위해 주어진다. 이 새로운 시스템은 약리학 시금 및 흡수 이들 모두 야생형의 피침 형 단자에 중요한 염료 및 유전자 변형 동물의 방출을 기계적으로 유발에 적합하다. 라벨 강도의 조절 성 영향의 예는 제공됩니다.
Introduction
그들은 일반적으로 피부 또는 다른 주변 조직에 깊이 묻혀로 Mechanosensory 신경 종말은, 현장에 접근, 일반적으로 작은 확산 분산 어렵다. 이를 시각화, 따라서 일반적으로 녹색 또는 노란색 형광 단백질 (GFP / YFP) 1 형광 라벨의 유전자 발현에 마우스 라인을 얻는 연장 immunolabeling / 염색 시간, 또는 지연과 비용 다음 단면이 필요합니다. 여기서 우리는 편리 조직과 연구를위한 모낭의 구 심성의 많은 수에 액세스 할 수있는 빠르고 간단한 방법을 보여, 그들은 신속 단자 기능 2의 광학 모니터링에 표시 할 수있는 방법. 연습으로, 영상을 해부에서 전체 기술은 거의 2와 같은 시간에 완료 할 수 있습니다.
감각 축삭의 피침 형 단자는 각각, 포유 동물의 모낭은 모발 모낭의 상피 주위 펠리 세 이즈를 형성에 분포아교 / 슈반 세포 사이에 끼워 단말기는 2-4를 처리합니다. 단말의 목적은 서라운드 모발의 기계적 변위를 검출하는 것이다. 이들은 빠르고 느리게 적응 엔딩 혼합되어 있지만, 주로 머리의 움직임에 응답하여 활성의 짧은 버스트를 생성한다. 전형적으로, 소성에도 계속 변위의 존재 하에서 매우 빠르게 이동이 중단 될 때 정지한다.
광학 방법으로 피침 형 단자를 연구하는이 쥐의 날개 모델은 이러한 결말의 구조와 기능 연구를위한 많은 유리한 기능을 가지고 있습니다. 귓바퀴의 피부 주로 두 층 사이의 연골 조직의 소량, 백투백 나란히 놓이는 것이다. 피부 인해 신체의 다른 영역에 약하게 접착 결합 조직에 대하여 최소량의 매우 얇고 쉽게 해부. 쉽게 분리 피부 층 따라서, 모공 및 단자에 좋은 액세스 할 수 있습니다. 신경 분포쉽게 접근하고 식별 할 수 있습니다. 모낭은 더 드문 드문 여포의 개인 또는 소규모 그룹의 이미지를 용이하게, 다른 피부 지역에 비해 배포됩니다. 얇은 기본 진피층 때문에 추가 처리없이 형광 현미경으로 촬영에 이상적입니다, 염료 및 약리학 적 약물에 좋은 접근성을 제공합니다. 고정 또한 조직 학적 처리 후에, 정착 염료를 사용하는 경우, 아날로그 표지 단자의 영상은 살아있는 단말이거나 할 수 있습니다.
우리는 흡수 (세포 내 이입)와 스티 릴 피리 디늄 염료 (FM1 – 43의 릴리스 (엑소 사이토 시스)에 의해 입증 재활용은 피침 엔딩에서 발생하는 막, 표시하려면이 준비를 사용하고, N – (3 triethylammoniumpropyl를) -4- (4- (디 부틸) 스티 릴) 피리 디늄 브로마이드). 염료는 없습니다, 그러나 크게 투자 슈반 세포가 2를 처리 레이블을 보인다. 우리는이 염료의 흡수 / 릴리스되었습니다, 따라서 연구를 막ecycling, 비정형 (포스 포 리파제 D-결합) 대사성 글루타메이트 수용체를 통해 글루타메이트 변조에 따라 달라질 수 있습니다. 간단한 자극 및 분석 프로토콜의 결과를 설명하고, 공통 전위 분석 문제도 다룹니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bewick 및 베츠 원래 N- 피리 디늄 시냅스 소포 막 로컬 재생을 모니터링 스티 릴 피리 디늄 브로마이드 7-10 염료 관련 (3- triethylammoniumpropyl) -4- (4- (디 부틸 아미노) 스티 릴)를 개발 하였다. 염료를 흡수하고, 따라서 증가 된 형광 따라서 시냅스 소포 막 내면화 (이입)를 반영한다. 그 후,이 내면화 염료가 더 전기적 활동에 의해 다시 방출 될 수있다, 염료 손실을 보여주는 것은 소포 막 외부화 (세포 외 유출)를 모니터링합니다. 시냅스, 이는 신경 전달 물질 분비에 대한 프록시이다. 동시에, 우리는 이러한 염료 차 mechanosensory 신경 종말 (7) 레이블을 발견했다. 최근에 11 Bewick, 은행 및 동료는이 성숙, 차별화 된 mechanosensory 터미널 생체에 유사한 과정을 반영하는 것으로 나타났다. 여기서 다시, 염료는 글루타메이트를 해제 구조적으로 재활용 50 나노 미터 직경 '시냅스와 같은'소포 (SLV는)을 레이블을 붙입니다.mechanosensory 터미널에서, 자신의 시냅스 대응과는 달리,이 재활용은 주로 자연이다. 또한, 기계적, 단순히보다 전기 자극에 의해 조절된다.
문화 및 달팽이관의 유모 세포, 특히 일반 및 스티 릴 피리 디늄 염료의 스티 릴 염료의 감각 뉴런에 대한 mechanosensory 채널을 차단하고 비가 역적으로 내부 멤브레인 (12) 라벨의 mechanosensory 채널을 통해 전달하는 것으로 나타났다. 그러나, 근육 스핀들 (11)의 2 또는 IA 엔딩에서 피침 형 어미와 같이 여기 현장에서 차별화 된 mechanosensory 터미널에서 비교 스티 릴 염료 농도에서 기계적 (13), (14)을 자극하지 않는 유모 세포에, 라벨은 막 엔도 시토 시스입니다. mechanosensory 신경 말단에서, 예를 들어, 표지는 가역적이고, (2), 11 (1) 여기서 사용되는 농도에서 mechanosensory 반응을 차단하지이 엔딩에 채널을 투과하여 일부 염료 국제화 완전히 배제 할 수는 없지만 5., latrotoxin에 가까운 총 destain 성숙한 터미널에서 라벨의 대다수는 재활용 소포 막과 내재화로 나타냅니다. 그러므로 우리는 염료의 흡수 및 방출에 약물 효과를 검사하여, 가장 최근에, mechanosensory 구 심성 터미널에서 SLV 재활용의 약리학 (2) 활동 의존성 (11)을 연구하기 위해이 기술을 사용하고있다.
가장 실용적인 기술과 마찬가지로, 재현성 반복과 연습이 필요합니다. 신뢰성을 보장하기위한 핵심 사항 중 일부는 이제 논의 될 것이다. 어린 동물에서 피침 형 라벨은 더 신뢰할 수있다 – 우리가 사용했던 작은 동물은 15g의 체중이었다. 이 경우 이유는 완전히 명확하지 않지만 이하의 결합 조직의 절개 적은 기계적 외상 및 제작이 필요 때문일 수있다신경 분포 층 위에 놓인 조직을 제거 할 때 AVES 덜 잔류 잔존.
전반적으로, 조직의 준비는 나이가 생쥐에서 다음 떨어져 피부 층을 박리되는 기술적으로 가장 어려운 실용적인 측면과 함께, 매우 간단합니다. 이러한에서 해부가 시작되는 피부 층은 바닥에 강하게 함께 준수하지만, 심지어 여기 층의 분리는 여백으로 훨씬 쉬워진다. 일반적으로 전방 피부처럼 감사하게, 혹은 결과적으로,이 얇은 한계 피부 영역은 일반적으로 가장 만족스러운 라벨을 제공합니다. 따라서, 특히 여백의 매우 얇은 피부를 파악하지 마십시오. 손상의 위험을 최소화 직접 폐쇄 집게로 추진보다는 잡고 간접적으로 준비를 조작, 또는 가능성이 필수적인 이해에만 강하다는 조직을 표시하여야하는 경우합니다. 이 주 저와 같이 즉시 모공 위에 놓인 '시트 폴리스티렌'층을 제거에 철저이미징 및 의약품 접근에 기계적인 방해. 그러나, 그것은 바로 아래에 기본이 손상 등의 구조 (즉, 멀리 스트립) 신경 네트워크와 단말기와 신체 접촉을 최소화하는 것이 필수적이다. 주된 형광 피지선에서 노란색 / 흰색이면, 머리 샤프트 기지 및 황색 / 오렌지 피침 엔딩의 몇 초승달의 눈에 띄는 자동 형광,이 신경 얼기 층 및 관련 피침 형 단자 통관시 제거 된 나타냅니다. 이것은 나이 (> 30g) 마우스와 주요 문제가 나타납니다. 염색 절차 전반에 걸쳐 모든 30 ° C에 있고, 잘 산소 확인합니다. 표시된 단자 아직 살아 있음을 유의하십시오. 따라서, 염료 지속적인 자연 (제정) exocytic 출시 분비됩니다. 이는 R / T에서 느린 것이지만, 염료 손실을 최소화하기 위해 킬레이트 용액 촬상 제거 사이의 지연을 최소화하는 것이 좋다. 또한, 대한 간 그룹 비교의강도의 tudies,이 모든 그룹의 영상을 보장하기 위해 필수적인 것은 시간과 일치합니다. 촬상 전에 염료 킬레이트 제의 사용은 큰 이미지 콘트라스트를 개선한다. 그래서 비교적 비싼 반면, 킬레이트 단계는 양호한 이미지 품질을 확보하기위한 매우 중요하다. 사용하는 사이에 4 ° C에 저장하는 경우, 3 일 연속 – 킬레이트 사용은도 2의 해결책을 여러 번 재사용함으로써 최소화 될 수있다. 그것의 염료 격리가 포화 상태에 접근하고 도시, 눈에 띄게 핑크 진행되면 킬레이트 솔루션을 폐기하십시오.
촬상 중에, 강도 및 여기 광 노출 시간 모두의 누적 결과 이러한 살아있는 단자 광독성 손상에 대한 가능성을 인식. 이러한 고려 사항은 화상 품질이 주요 관심사이다 단일 이미지 평가시기, 덜 중요하다. 그러나, 최소로 여기 광에 노출을 감소 동력학 연구에서 반복 촬영 동안 중요하다. 이러한 염료를 개발하는 동안라벨 시냅스, 우리는 신경 말단에 극적이고 돌이킬 수없는 손상의 원인이됩니다 전체 전력 여기 조명에서> 1 분 동안 여기를 발견했다. 그들은 처음이어서 다음, 거대하게 확장 15 분 ~에 걸쳐 완전히 붕괴. 우리는 체계적으로 노출 시간과 강도의 상대적 기여도를 테스트하지 못했지만, 이러한 관찰은 원칙 모두를 최소화하는 것 좋습니다. 그래서, 여기 광 강도와 지속 시간이 좋은 이미지를 얻기에 상응하는 최소하고, 적절한 제어 이미지가 시간 코스 연구에서 촬영하는 것이 좋습니다. 각각의 시점에서, 데이터는 반복 된 촬상 조건에서 광독성 영향을받지 않는 것을 테스트하기 이전에 보지 않은 단말기의 추가적인 이미지를 촬영. 이 순진 터미널에서 라벨의 행동이 모공에 반복적으로 이미지화되는 것을 유사한 보장하는 것입니다.
다수의 인자 순 강도 (D)의 집단 내 가변성을 감소시킬 수있다ATA. 부적절한 염색에도 작은 면적을 크게 여포 간 데이터 변화에 영향을 미칠 수 있으므로 정확한 ROI를 배치, 특히 배경 ROI는 중요하다. 순 강도의 변화는 각각의 모낭이 엔딩의 방어벽에 의해 둘러 쌓여 방법을 완전히에 의해 영향을 받는다. 포위의 정도가 관련 매개 변수의 경우 예를 들어 비교, 그림 2에서 볼 수있는 거의 원형 패턴 그림 1B에있는 초승달 모양의 라벨 분배. 더 복잡한 분석, 아마도 자동화 된 소프트웨어 탐지 및 임계 값을 사용하여이 필요합니다. 심지어 가장 정확하게 분석 뿌리 그룹에 대한 강도 분포는 일반적으로 인구의 중간 값보다는 수단의 사이에 처리 비교를위한 비모수 통계의 사용을 필요로 (그림 3 참조) 분산되지 않도록주의하시기 바랍니다. 이러한 비율 오으로 강도를 표현하는 등 표준화 기술,또는 대조군 F 반대측 제어 여러 제제들, 상기 변동을 줄이기 위해 적용될 수있다했다. 마지막으로 고려해야 할 항목 기술은 약리 시험을위한 실험 설계이다. 약리학 적 연구 중에 염료 도장 전에 30 분 동안 약액의 제조를 사전 배양한다. 다음으로, 염료 용액 중의 약물 농도를 유지한다. 약물이 차량 식염수 플러스 비히클에 용해되는 경우 대조군, 어느 식염수를 사용하거나.
본 문서에서는이 새로운 날개 준비가 최소한의 준비와 피부에 mechanosensory 엔딩의 높은 품질의 이미지를 제공하는 방법을 보여줍니다. 우리는 또한 소포 재활용의 두 가지 중요한 측면의 약리학을 조사하는데 사용될 수있다 나타낸다. 우리는 글루타메이트 수용체 효능 색소 내재화 (엔도 시토 시스의 마커)를 증가 할 수 있으며, 둘째, 그 염료 latrotoxin (세포 외 유출의 자극제)로 다시 손실 첫 나타낸다. 이는 준비의 중요성이온 기술은 터미널 기능, 구조 및 상호 관계의 광학 모니터링을위한 독특한 기회를 수득 이미징 실험 현장에서 피부 mechanosenory 단자 생활에 우수한 액세스를 제공한다는 것입니다. 후자의 목적을 위해, 우리는 또한 결합 된 광학 / 전기 생리 연구 (자세한 내용은 자매 조브 문서를 참조)에 사용하기 위해 추가로 개발했다.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 영국 의학 연구위원회 프로젝트 보조금 GSB에 G0601253와 RWB 및 GSB에 SULSA Bioskape 보조금에 의해 투자되었다
Materials
| PDMS – Sylgard 184 | Dow Corning | Flexible, inert, translucent solid silicone polymer. | |
| No. 3 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Austerlitz Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Very fine pins to attach pinna preparation securely to the PDMS with minimal damage. |
| FM1-43/Synaptogreen C4 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70020 | Fluorescent membrane probe that reversibly partitions into the outer leaflet of cell membranes. Used predominantly for monitoring vesicle membrane endo-/exocytosis. |
| Advasep 7 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70029 | A sulfonated b-cyclodextrin derivative that chelates FM1-43 (& other styryl pyridinium dyes) out of the exposed membranes, leaving internalised dye to be seen more clearly by lowering the background labelling/fluorescence. |
| Retiga Exi Fast 1394 | Qimaging | Monochrome, cooled CCD camera – basic model | |
| Volocity 3D Image Analysis Software | Perkin Elmer | Volocity 6.3 | Image capture and analysis software. |
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