הקלטה משולב של תוויות מסוף פלט ועצב מבחינה מכנית מאולצת מביא ב Endings עכבר זקיק השיער אזמלי
Summary
A simple and novel technique for recording afferent discharge due to mechanical stimulation of lanceolate terminals of palisade endings innervating mouse ear skin hair follicles is presented.
Abstract
טכניקה לנתיחת הקלטת רומן מתוארת על ירי מביא ניטור עורר על ידי עקירה מכאנית של שערות פינת העכבר. הטכניקה היא מאוד חסכוני התחייב בקלות עם חומרים נפוצים במעבדות אלקטרופיזיולוגיה ביותר, או לרכוש בקלות. דיסקציה היא פשוטה ומהירה, עם התזוזה המכאנית מסופקת על ידי רקיק electroceramic הגנרית נשלט על ידי תוכנת קניינית. אותה תוכנה גם רשומה ומנתח את תפוקת electroneurogram. ההקלטה של הפעילות העצבית העוררת היא דרך מגבר הפרש מסחרי הקשורים microelectrodes זכוכית הרגיל אש מלוטשת. עצות מועילות ניתנות לשיפור האיכות של התכשיר, הגירוי ואת תנאי ההקלטה כדי לייעל את איכות הקלטה. המערכת מתאימה עבור מנסה לאמוד את תכונות אלקטרו אופטיות של מסופי אזמלים של סופים משוכים של זקיקי שיער, כמו גם אתתוצאות מהמניפולציה התרופתית ו / או גנטית שלהם. דוגמא של שילוב הקלטת חשמל עם גירוי מכאני וסימון עם צבע styryl פירידיניום חיוני היא נתונה.
Introduction
המסופים אזמלי של אקסונים חושי innervating זקיקי שיער אצל יונקי יוצרי Palisades ברחבי האפיתל שיער-הפיר. מטרתם היא לזהות תזוזה מכאנית של השערות הם מקיפים. הם תערובת של במהירות ולאט לאט התאמת הסופים כי בעיקר לייצר צרורות קצרות של פעילות בתגובת תנועת שיער. פעילות מפסיק מהר מאוד כאשר התנועה נעצרת, אפילו בנוכחות של עקירה המשיך. כאן אנו מתארים את הפיתוח של מודל פינת murine זה ללימודי גומל של מבנה והתפקוד במסופי אזמלים. יש פינת תכונות רבות יתרון ללימוד הסופים אלה. ראשית, הפינה היא בעצם שתי שכבות של עור apposed גב אל גב, עם רקמות קטנות אחרות בין להפריע גישה זקיקי והמסוף. העור הוא דק מאוד גזור בקלות בשל כמויות מינימליות של רקמת חיבור קשה. העצבוב הוא נגיש וקל לזיהוי. בעוד שיער follicles נוכח, הם מופצים יחסית בדלילות, הקלת הגירוי של קבוצות בודדות או קטנות של זקיקים מכאניים. שכבת הדרמיס הדקה הבסיסית נותנת נגישות טובה אל מסוף העצב עם תרופות פרמקולוגיות וצבעים. זה גורם להם במיוחד אידיאלי עבור בדיקות הדמיה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. ההדמיה יכולה להיות במסופי חיים, או לאחר קיבוע ועיבוד היסטולוגית נוסף.
התגובות של תאי עצב mechanosensory innervating זקיקי שיער באופן מסורתי נחקרו מכרסם vibrissae 1,2 ו, ובמידה פחותה, בהכנות עור מבודדות 3,4. אלה למדו אותנו הרבה על העקרונות הכלליים של פיזיולוגית mechanosensory במסופים העצבים סביב השערה. הכנת vibrissal מאפשרת שליטה מעולה על התנועה של זקיק שערה אחת. עם זאת, זה יכול להיות קשה לפענח את התפוקה בשל מורכבותו, כמו vibrissalזקיקים להכיל לפחות 8 סוגים שונים של סיום mechanosensory מובחן מבחינת אנטומית 5 ואת ההתאמה של סוגים מורפולוגיים אלה מענה ספציפי אלקטרו היא עדיין עניין של מחלוקת. עכבר העור / הכנת עצב saphenous משמשת לרוב במצב המקולף שלה לחקור תגובות מגע וכאב. העצבוב של זקיקי שיער תכשיר כזה מורכב פחות אבל הצפיפות של זקיקי השיער, בתוספת בנוכחות שלושה סוגי זקיק שונים (שומר, מרצע / auchene ושערות זגזגו) בסמיכות כזו 6, פירושו ללמוד את התגובה החיסונית הספציפית של זקיק בודד או סוג אחד של הסוף שוב מאתגר. יתר על כן, הכנה זו כרוכה לנתיחה מורכבת. לבסוף, בשני vibrissal והכנות עור אחרים, קשה לדמיין את הקצוות מעורבים בעוד הכנות vivo לשעבר עדיין בחיים. לפיכך, חתך רקמות נדרש גם קווי עכבר להביע GFP. משתנvely, זה דורש עיבוד היסטולוגית עוד / אימונולוגיות כגון קיבוע ו / או דגירת נוגדן עבור immunofluorescence.
לפיכך, אנו פתחנו הכנת הפינה והשתמשנו בו כדי לבצע הקלטות חשמל מאוכלוסייה מוגבלת של afferents זקיק שיער ולהראות כי רכיבה על אופני קרום מתרחשות הסופים אזמלי אלה, שמעידים ספיגים של צבעי styryl פירידיניום. לבסוף, הראינו כי הצבע לא להפריע רגישות מכאנית, סימן שהוא לא יחסום את ערוצי mechanotransduction. התוצאות של פרוטוקולי גירוי וניתוח פשוטים מומחשות.
Protocol
Representative Results
Discussion
הנה, פתחנו תכשיר פשוט יחסית, יכול להיות גזור במהירות, יש צפיפות זקיקי שיער נמוכה ומאפשר גירוי מכאני סלקטיבית יחסית של מספר קטן של זקיקי שיער. הוא נגיש בקלות עבור הקלטת אלקטרו הדמית ניאון לחיות תאים, הכוללות התגובות לצבוע יישום כדי להמחיש את זקיקי שיער מגורים באופן מכאני, כלומר זקיקי הדמיה עם תגובות אלקטרו מוגדרות. למרות שאנו עדיין לא עשינו זאת, מערכת זו גם נראית נוחה ונגיש תת-חלוקת העצב התחושתי עבור יחידה אחת הקלטה (חושי האקסון יחיד) ושימוש GFP ביטוי ממוקד המאפשר הדמיה שהסתיים מורפולוגיה מסוף חושית.
השתמשנו בהכנת עור האוזן לחקור את המאפיינים של הפנמת שחרורו של צבעי pridinium styryl קרום ניאון 7, טכניקה שפותחה במקור ללמוד vesic המקומימחזור קרום le במסופים הסינפטי 8. סינפסות, הדמיה גם משולבת בקלות עם הקלטת אלקטרו סימולטני של תגובות במסופים מזוהים 8,9. זה היה במחקרים המוקדמים אלה שאנחנו קודם ציינו הצבעים הופנמו גם על ידי קצות mechanosensory 10. עבור עצב סנסורי בתרבות בתאי שיער שבלול, חלק גדול מן התיוג על ידי צבעי styryl פירידיניום נראה לערב צבע עובר דרך ערוצי mechanosensory, אשר לאחר מכן הם לחסום 11,12. הצבעים עליו מדבקת ממברנות תאיות, וסימון זה הוא בלתי הפיך. עם זאת, בתאי שיער שאינם מגורים מכאני 13,14 ו מסוף עצב תחושתי בדיל עיקרי מלא באתרו, כגון סופי Ia ב כישור שריר 15, ובסופו של הסופים אזמלי כאן 7, תיוג לצבוע styryl משקף אנדוציטוזה הממברנה, תיוג מאז הוא הפיך ואינו לחסום את מיל mechanosensoryponses 7,15,16. בעוד כמה הפנמה לצבוע ידי חלחול ערוץ הסופים אלה לא ניתן לשלול לחלוטין, ברור מן הירי נמשך במהלך דגירה לצבוע ואת ההפיכות של התיוג שהרוב הגדול של התיוג במסופי בדיל באתרו הוא על ידי הפנמה עם שלפוחית מחזור קְרוּם. לכן, טכניקה פשוטה זו משמשת בקלות לניטור חשמלי ואופטי משולב של מגוון רחב של פונקציות מסוף mechanosensory ברקמות vivo לשעבר.
כמו ברוב טכניקות מעשיות, שחזור ידרוש חזרה ותרגול. כמה נקודות המפתח שווה תשומת לב מסוימת תפורט עכשיו. במהלך פגישת דיסקציה הקלטה, למקסם כדאי רקמות והישרדות ידי הבטחת ההכנה perfused כל זמן עם מי מלח רווה לגמרי עם 95% O 2/5% CO 2. ודא שיער זקיקים אינם שנעקרו במהלך תהליך זה, ש"שich תעודד ירי הסוף חושי. כך או להשתמש במערכת זלוף רציפה, זרימה למינרית, או גז בועה בעיון את אמבטית האיבר עם צינורות בסדר ממרחק מן ההכנה, או בזהירות לרענן פתרונות לכל דקה '20-30, שמירה על ההכנה מתחת לפני השטח המלוח בכל העת. אלקטרודות הקלטת יניקה מבוצעות על ידי שינוי טפטפות בורוסיליקט אלקטרודה החדה המשמשת בדרך כלל לכלי הקלטה תאית. ראשית, בזהירות לשבור את הקצות החדות עם # 3 מלקחיים לתת הקוטר הפנימי המתאים כדי להתאים את העצבים-פולני אש מאוד קצרה (<1 sec) חשיפת להבת מבער בונזן (ראה 2.4 ו -2.5). כדי לקבל יחס אות לרעש טוב בעת הקלטה, זה הכרחי כי העכבה החשמלית (התנגדות) בשתי אלקטרודות אלו הן מוגדלת ושווות. עושה זאת על ידי מתן תשומת לב לפרטים הבאים של שתי אלקטרודות. עבור האלקטרודה הקלטה, להבטיח את הקוטר הפנימי הוא התאים בקושי עבור העצב, ואת האורך המרבי של neRVE הוא נשאב לתוך האלקטרודה ההקלטה. נסה להשתמש רקמת חיבור המקיפה את העצבים לאטום את קצה האלקטרודה ביעילות. לחלופין, או בנוסף, לצייר את הקצה הצר של פיסה כראוי בגודל, מחודדת של רקמת שומן לצד העצב. לאחר מכן, חבר את קצה האלקטרודה על ידי יישום יניקה חזקה דקות ~ 1 עם מזרק 50 מ"ל מצורף צינורות. לתיקון קצה היטב אטום, החלת יניקה חזקה פשוט תחזק את האפקטיביות של התקע ולא למשוך יותר נוזלי או עצב. כדי למנוע נזק עצבי, לעומת זאת, להבטיח כי רקמת החיבור הוא שצריך לרפד העצב כתוצאה מהלחץ על החומר שמסביב וסחוס EAM. האלקטרודה האדיש צריך לחקות את עכבת ההתנגדות / של האלקטרודה ההקלטה ככל האפשר. זה עזר מאש-ליטוש בזהירות את המידע לשלטונות קטן צמצם ככל האפשר מבלי איטום זה. אם התנגדות נוספת נדרשת, ולאחר מכן חבר את הקצה של האלקטרודה האדיש עם adipose רקמת חיבור, כפי שתואר לעיל עבור האלקטרודה ההקלטה.
Electroceramic נותן שליטה מעולה על עקירה מכאנית, הוא במרחב ובזמן. עם זאת, לטפל ביצוע חיבורים חשמליים – טמפרטורות גבוהות להשמיד אותם, ועל כן אין להשתמש הלחמה חמה. להשתמש בדבק אפוקסי טעון מתכת, או להשתמש בשקע מומחה שכיבות לנכונות מומלץ על ידי הספק. זה הן יחזיקו אותו בחוזקה ולהקים קישוריות חשמל. צרף את החללית מגרה זכוכית אל electroceramic עם שרף אפוקסי רגיל. אש-פולנית בסופו של 10 ס"מ סטנדרטי x צינור נימי זכוכית בורוסיליקט 1.5 מ"מ קוטר המשמש להכנת תיקון או אלקטרודות לחיתוך הקלטה אלקטרו כדי למזער את הסיכון של נזק לרקמות. אם גירוי זקיק בודד שיער נדרש, אש-פולני הקצה להתאים שערה אחת, ומקם את החללית עם שערה אחת בתוך הצמצם הפתוח. זה נותן שליטה מעולה על שערה אחת. לקבלת dy styrylתיוג אלקטרוני, הוא אחיד בדרך כלל יותר ברקמות מבעלי חיים צעירים. זה לא לגמרי ברור מדוע, אבל זה כנראה משקף פחות טראומה מכאנית והסרת רקמות עמוקה יעילה יותר מן הרקמות הצעירות. להיות יסודי בהסרת פוליסטירן הדומה שכבת הקצף המכסה את בסיסי זקיק שיער. עם זאת, להימנע מלהיות מדי נמרצת, כמו זה סיכוני הסרת השכבה מקלעת העצבים ומסופי אזמלי הקשורים. אם יש מעט או ללא תגובה חשמלית לתנועת זקיק שיער, ויישום לצבוע styryl מוביל תיוג שולט של בלוטות חלב (צהובות / לבן), עם autofluorescence הברור של בבסיס השערה ולא סופים אזמלי (כתום / צהוב), אישור נלהב יתר על זיקת הרקמות שמתחת לפני השטח. לבסוף, באמצעות סוכן-chelating לצבוע לפני ההדמיה משפר באופן משמעותי לעומת תמונה ואיכות התמונות הסופיות.
טכניקה זו יכולה להיות שימושית במגוון של מחקרים נוספים. שיתוף אלהULD כולל, למשל, בדיקות סקר לאיתור הערוץ mechanosensory (הים) האחראי עורר תגובות מתיחות, על ידי דוגרי ההכנה עם ליגנדים תרופתיים סלקטיבית עבור ערוצי מועמד או הקרנת קווי עכבר עם ערוצים כאלה שנמחקו גנטיים. זה האחרון יכול להיות משולב עם ערכת קרינה של כל שינויים במורפולוגיה מסוף בשל מניפולציה גנטית בקווי עכבר, למשל עם ביטוי של GFP הצמוד Npy2r 17. דוגמא סופית עשויה להיות חוקרת את תפקיד השלפוחית דמוית הסינפטי (ספקים חד-הלשונית) 7 במסופי אזמלים אלה על ידי בחינת ההשפעה של מאפננים ממחזור SLV (Ca, Mg, latrotoxin, הליגנדים קולטן הגלוטמט) על עורר תגובות למתוח ספיגת צבע styryl /לְשַׁחְרֵר. לפיכך, טכניקה חדשה זו פותחת מגוון של שדרות פוטנציאל מעניינות של מחקר במדעי מוח mechansensory.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The work was in part funded by UK Medical Research Council project grant G0601253 to G.S.B. and R.W.B.
Materials
| PDMS – Sylgard 184 | Dow Corning | Flexible, inert, translucent solid silicone polymer. | |
| No. 3 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Austerlitz Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Very fine pins to attach pinna preparation securely to the PDMS with minimal damage. |
| AC Differential Preamplifier | Digitimer | Neurolog NL104A | Amplifying the size of the incoming afferent electroneurogram. Differential recording minimises the extraneous electrical noise and baseline drift. |
| High/Low-pass Filter | Digitimer | Neurolog NL125 | Signal conditioning, by reducing extraneous electrical noise to ensure best signal to noise ratio. |
| Spike Trigger | Digitimer | Neurolog NL201 | Sets the event detector threshold and displays it on the oscilloscope. This shows the action potential detection efficacy. |
| Audio Amplifier & speakers | Digitimer | Neurolog NL120S | Useful audio monitoring for the presencec of electrical firing of the sensory endings while adjusting the mechanical stimulation preparation down the microscope |
| Oscilloscope | Digitimer | PM3380A | We use this old model but any standard oscilloscope will suffice. |
| Piezo electroceramic wafer | Morgan Electroceramics, Southampton UK | PZT507 | Electrophysiology/computer interface |
| Piezo electroceramic powersupply | Home made | 0-200V DC output to drive the ceramic wafer displacement, with variable electronic control of output via recording/stimulation software and computer interface. We use Spike2 software and 1401micro computer interface. | |
| Electrophysiology Software | Cambridge Electronic Design (CED) | Spike2 v7 | Electrophysiology recording, stimulation and data analysis software |
| Laboratory interface | Cambridge Electronic Design (CED) | 1401 micro | Electrophysiology interface, between the amplifier/filters and the computer. It inputs the electroneurogram and also drives the electroceramic movement. |
| FM1-43/Synaptogreen C4 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70020 | Fluorescent membrane probe that reversibly partitions into the outer leaflet of cell membranes. Used predominantly for monitoring vesicle membrane endo-/exocytosis. |
| Advasep 7 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70029 | A sulfonated b-cyclodextrin derivative that chelates FM1-43 (& other styryl pyridinium dyes) out of the exposed membranes, leaving internalised dye to be seen more clearly by lowering the background labelling/fluorescence. |
| Retiga Exi Fast 1394 | Qimaging | Monochrome, cooled CCD camera – basic model | |
| Volocity 3D Image Analysis Software | Perkin Elmer | Volocity 6.3 | Image capture and analysis software. |
References
- Cahusac, P. M. Effects of transient receptor potential (TRP) channel agonists and antagonists on slowly adapting type II mechanoreceptors in the rat sinus hair follicle. J. Peripher. Nerv. Syst. 14 (4), 300-309 (2009).
- Fagan, B. M., Cahusac, P. M. Evidence for glutamate receptor mediated transmission at mechanoreceptors in the skin. Neuroreport. 12, 341-347 (2001).
- Price, M. P., et al. The mammalian sodium channel BNC1 is required for normal touch sensation. Nature. 407 (6807), 1007-1011 (2000).
- Ranade, S. S., et al. Piezo2 is the major transducer of mechanical forces for touch sensation in mice. Nature. 516 (7529), 121-125 (2014).
- Ebara, S., Kumamoto, K., Matsuura, T., Mazurkiewicz, J. E., Rice, F. L. Similarities and differences in the innervation of mystacial vibrissal follicle-sinus complexes in the rat and cat: a confocal microscopic study. J. Comp. Neurol. 449 (2), 103-119 (2002).
- Li, L., Ginty, D. D. The structure and organization of lanceolate mechanosensory complexes at mouse hair follicles. eLife. 3, 01901 (2014).
- Banks, R. W., et al. Glutamatergic modulation of synaptic-like vesicle recycling in mechanosensory lanceolate nerve terminals of mammalian hair follicles. J. Physiol. 591 (10), 2523-2540 (2013).
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255 (5041), 200-203 (1992).
- Reid, B., Slater, C. R., Bewick, G. S. Synaptic vesicle dynamics in rat fast and slow motor nerve terminals. J. Neurosci. 19, 2511-2521 (1999).
- Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. J. Neurosci. 12, 363-375 (1992).
- Meyers, J. R., et al. Lighting up the senses: FM1-43 loading of sensory cells through nonselective ion channels. J. Neurosci. 23, 4054-4065 (2003).
- Drew, L. J., Wood, J. N. FM1-43 is a permeant blocker of mechanosensitive ion channels in sensory neurons and inhibits behavioural responses to mechanical stimuli. Molecular Pain. 3 (1), 1 (2007).
- Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. FM1-43 reveals membrane recycling in adult inner hair cells of the mammalian cochlea. J. Neurosci. 22, 3939-3952 (2002).
- Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. Apical endocytosis in outer hair cells of the mammalian cochlea. Eur. J. Neurosci. 20 (1), 41-50 (2004).
- Bewick, G. S., Reid, B., Richardson, C., Banks, R. W. Autogenic modulation of mechanoreceptor excitability by glutamate release from synaptic-like vesicles: evidence from the rat muscle spindle primary sensory ending. J. Physiol. 562 (2), 381-394 (2005).
- Watson, S., Aryiku, C., Banks, R. W., Bewick, G. S. Comparison of gadolinium and FM1-43 as blockers of stretch-evoked firing of rat muscle spindle afferents. Proc. Phys. Soc. 21 (PC22), (2010).
- Li, L., et al. The functional organization of cutaneous low-threshold mechanosensory neurons. Cell. 147 (7), 1615-1627 (2011).
