机械刺激传入输出和神经末梢标签联合录制在小鼠毛囊披针形结局

鼠标验尸组织收获必须使用认可的道德的方法。在英国，颈椎错位是成年小鼠（英国动物上市附表1的方法（科学程序）法案，1986年，欧盟指令63分之2010/ EU）政府批准的方法。这是立法阿伯丁的动物福利和伦理审查委员会的大学谁审查和批准了以下协议中使用的所有程序在本地执行。 注意：这些方法在银行等报道研究中使用7。 1.准备耳朵电解剖前，制备标准生理盐水，如Liley的（1956）中，用90％ 的 O 2/5％CO 2饱和的。 Liley的盐水（MM）是由： 碳酸氢钠 （12），氯化钾（4），KH 2 PO 4（1），氯化钠（138.8），MgCl 2的（1）， 氯化钙 （2）和葡萄糖（11）。 人道安乐死成年小鼠不破坏靠近耳朵的头骨。这里，我们使用的C57 / BL6J和MF1小鼠，但可使用任何标准的实验室小鼠品系。理想的是，使用是<25 g只有电记录是与苯乙烯基染料标记进行组合，如在较大的小鼠标记是不太可靠的小鼠中，经常被仅在限制外切地区发现。 大剪刀或骨剪取出头。 放置头部背侧在充气Liley在宽有底解剖盘（50厘米，通常方便）在一个立体声解剖显微镜的阶段。定期（约10分钟）水闸或用浸入盐水毒气头。 小心切开和肌肤的外耳（耳廓）与弹簧弓形剪刀和＃3镊子的基座分开，露出外耳道（EAM）的软骨。确定三叉神经的分支（下颌分裂，MDV）和耳大神经，因为他们出现˚FROM通过软骨基地下颌关节和项目的裂头骨支配凹（前）和凸（后）耳廓皮肤方面，分别为。 附近的头骨，发现其中两个神经分支出口在颌骨和乳突之间的凹槽。轻轻拉耳廓从头骨最大限度地远离它们的长度和削减接近头骨尽可能的神经。 移除头部与弹簧弓形剪刀耳廓，注意避免分割神经的远端树桩，并在该被除去耳朵的基最小密毛皮的量。 转移到耳廓灵活的硅橡胶（PDMS）-lined菜充满了气液固三相Liley的液体。通过将其在其最窄（最前）点开EAM。拼合耳廓，前皮肤（凹）朝下，脚到PDMS仔细用6-8〜规则间隔很细（〜直径0.2mm）昆虫针的边缘。 雷姆完全奥雅纳耳廓的后方面的皮肤和部分地与＃3镊子除去由钝器解剖耳廓软骨，确保前皮肤保持不变。 用细昆虫针的角度把握以＃3钳，轻轻地延长了MDV的皮肤和软骨EAM之间出现向后的分支（通常为2）。这些引脚与最好的可能的昆虫针的PDMS，刺穿结缔组织相邻的切端，而不是神经干自己。 删除其中大部分在周围的结缔组织，小心避免与过量拉或受损。 2.电生理记录设置针脚耳廓皮肤与周围的边缘罚款昆虫针一个录音室的PDMS内衬基地（〜6％至8耳），放置清洗神经在耳朵附近的两个电极吸基地 – 一个用于记录（以走神经）和OT她一副无所谓的电极（提供中性信号，差分放大器，请参阅7）。 对于记录电极，仔细匹配孔和开口的两个神经的组合厚度的内直径，所以它们适合作为紧贴尽可能和一样大的长度尽可能。 绘制神经成通过温和抽吸从附着有硅橡胶管的另一端2毫升注射器的电极。确保神经都直了，不折叠或弯了腰。 通过使用更强的吸力吸取结缔组织或脂肪组织，以形成一个插头，其紧紧地密封在神经周围的孔发展高电阻/阻抗配合。 吸满盐水的其他（无所谓）电极（如有必要，也可以通过毛细作用填写）。 放置相同记录导线（银或铂）到记录电极的内孔以接触盐水和神经（录音）或电极的收窄，火抛光结束（无所谓）。每个电极分别焊接到两芯屏蔽电缆的不同的内核。放置浴（接地）电极（银/氯化银沉淀）到浴，并将其研磨成连接到记录电极两芯电缆的屏幕。 从两个电极饲料的电活动成差分放大器，滤波器（带过去了0.2-2千赫），并查看示波器屏幕上的独立的通道。检查通道A（记录）和通道B（无所谓）电气噪声水平看起来相似。在此阶段，可能无法看到信道A中的正常的自发动作电位之前的两个电极是平衡的。 通过增加记录（通道A）或漠不关心（通道B）电极的阻抗纠正背景噪音电极之间的差异。通过乳晕吸吮（脂肪）结缔组织进一步陷入要么电极做到这一点，和/或在50毫升注射器施加更大的抽吸力。 一旦以这种方式“均衡”，切换回差（AB）记录和查找在跟踪自发动作电位（APS），或当在耳廓的保证金抚摸头发。如果没有活动（扣球）看到，重新检查神经的记录电极的紧密配合，并在冷漠电极乳晕结缔组织 – 通常是更严格的（高电阻）密封，并在两个更加平等的阻抗电极，就更好了。通过实践，这将实现良好的质量（> 2：1）信号：信噪比。 记录通过计算机上运行的实验室接口和电软件的电图。尖峰的音频输出是非常有用的，并且可以通过一个音频放大器和相关音频扬声器馈送neurogram来实现。调整门槛只是基线噪音（因没有白-n的上述鉴定瓦兹'嘶嘶声'）。 为了增加药物或荧光苯乙烯基染料获得了披结局，小心剥离附近的耳廓缘子真皮脂肪层，在打开的约5毫米×5mm的窗口露出真皮和卵泡基（ 图1A，B ）。 （在刚生产出来的窗口层面如适用）引脚背部脂肪，清除耳部皮肤的约1毫米的折叠在领先幅度，而使皮肤并列层之间的明确生理盐水填充空白。轻轻抚摩一起用大头针或接地细镊子折叠的边缘突起，不沾皮肤毛发，来定位音频输出示波器和鲜明的最大输出AP的“持久性有机污染物”区域“点击”和。 3.录音刺激诱发的动作电位连接到Cerami研究火抛光10厘米硼硅玻璃微电极 – 机械刺激探头位置Ç压电致动器 – 所以运动是与皮肤褶皱平行。将尖端皮肤约0.5-1毫米倍，所以倒是头发而不是外观。慢慢手动移动探头尖端偏转的头发，并观察/倾听扣球确认有效的刺激。 使用该软件可带动1-3毛机械刺激（ 如 3秒在5 Hz的正弦波，每10秒排量探讨200-500微米），并记录在神经刺激诱 ​​发反应。 在10秒的间隔给几个相同的机械性刺激列车。优化探针位置重复性，再根据实验方案（从10秒至30秒如降重复率）降低的刺激频率。 使用该软件使用简单的阈值设定为〜2倍的高频噪声幅度和最大AP的〜25％以鉴别AP样活性例如 。 算上接入点跨越的门槛为'事件'，量化生产的AP的频率和特点。 4.录音刺激诱发射击与N-（3- triethylammoniumpropyl）-4-（4-（二丁基氨基）苯乙烯基）吡啶鎓二溴化物标记组合为了检验苯乙烯基染料对刺激诱发传入射击和末端标记的影响，增加选择的苯乙烯染料的适当的浓度，浴液，并继续与电气录音。 所需的曝光时间（通常至少30分钟）后，准备用于观看毛囊的制备。通过去除固定销展开皮瓣，并露出真皮清区揭示末端标记。 洗去外部染料与不含染料的生理盐水，使3个完整盐水变化。 孵育毒气无染料生理盐水10-15分钟，最后变化，让最顽固染料的污染，从曝光/外部膜滤。 去除残留在用多价螯合剂（sulfobutylatedβ-环糊精，1毫米，5分钟）在盐水膜非内化染料。 录音室转移到直立落射荧光显微镜的舞台，并与台/滑动运动机构从事室。 照亮适当的苯乙烯基染料的激发光的制备。使用10X 25X或荧光显微镜物镜观察卵泡标签（ 图1）。