Комбинированный оптогенетика и сублимационной перелом реплики иммунноокрашивания по анализу Устройство ввода специфических рецепторов глутамата у мышей Amygdala

Процедуры с участием субъектов животных были одобрены Regierungspraesidium Тюбинген, Баден-Вюртемберг, Германия, и Совет по австрийской экспериментирования животных по вопросам этики, и были в соответствии с директивой ЕС по использованию животных в научных исследованиях. 1. Стереотактическая Инъекции ААВ-Channelrhodopsin2-YFP Примечание: Стереотаксические инъекции были проведены в соответствии с ранее опубликованного протокола 20. Готовят стерильные инструменты путем их нагревания при 180 ° С в течение 1,5 ч. Потяните острые (диаметром ~ 50 мкм) стеклянные пипетки для инъекций с использованием горизонтального микроэлектродного съемник набор со следующими параметрами: Heat = значение Ramp – 20, Pull = 0, скорость = 100, Время = 200, давление = 200. Примечание: Значение Ramp должно быть определено для каждой партии купленных стеклянных пипеток в соответствии с инструкциями, предоставленными производителем микропипетка съемника. Премикс 1 мкл раствора вируса и 0,2 мкл 0,1% раствора быстрого зеленого (для лучшей видимости раствора в стеклянной пипетке) в стерильном фосфатно-солевом буфере (PBS; 25 мМ, 0,9% NaCl, рН 7,4). Заполните стеклянную пипетку с помощью 10 мкл пипетки и гель-FIL советы. Для вирусной конструкции, использовать Раав-hSyn-ChR2 (H134R) -eYFP (серотип 2/9). Обезболить мышь с помощью небольшого животного анестезии устройство (3% изофлуран в кислороде для индукции). Используйте. Для этого исследования используют 3 мышей дикого типа в возрасте ~ 6 недель. Бритье головы между ушами и глазами и дезинфицируют раствором на основе повидон-йод. Нанесите мазь для глаз, чтобы предотвратить высыхание глаза во время анестезии. Подкожно вводят мышь с обезболивающим (мелоксикам основе, 0,1 мл 5 мг раствора / мл). Поместите мышь в стереотаксической рамы и поддержания анестезии с помощью газовой анестезии устройства (2% изофлуран в кислороде для технического обслуживания). Проверьте анестезии глубину отсутствием вывода конечностирефлекс перед продолжением. Поддержание стерильных условий как можно лучше в течение всей хирургической процедуры. Носите одноразовую лицевую маску, хирургический халат и перчатки. Делают кожу надрезать приблизительно 1 см на верхней части головы с помощью ножниц 20. Осторожно потяните кожу в сторону , используя тупой пинцет, зафиксировать с помощью зажимов , чтобы разоблачить поверхности черепа и очистить череп с H 2 O 2. Места инъекций Все на черепе с помощью тонкого наконечника перманентным маркером. Просверлить маленькое отверстие (примерно 1 мм в диаметре) в череп в отмеченном месте. Для одностороннего PIN / MGN инъекции в этом шпилькой, используйте следующие координаты: от темени (мм): 3,0 задние, боковые ± 1,8, брюшные 3,8. Маунт заполнены стеклянной пипетки на стереотаксической рамы, соединенного с инъекционной давления устройства и довести пипетку брегмы позицию. Оторвать кончик стеклянной пипетки с использованием тонких прямых наконечников щипцов. Убедитесь, что кончик пипетки открыт applyinга импульсы мало давления и наблюдения за экструзия капель раствора вируса. Перейти к требуемым координатам впрыска и вводят половину содержания пипетки (~ 0,5 мкл), используя следующие настройки на устройстве впрыска под давлением: давление 20 фунтов на квадратный дюйм, средняя длительность импульса 30 мс, среднее число импульсов 50. Оставьте пипеткой на месте в течение ~ 1 мин, прежде чем медленно (1 мм / мин) его втягивания. Чистый череп с PBS (рН 7,4) и снимите зажимы. Осторожно потяните кожу вместе, и сшивать разрез (3 – 4 узла). Применение дезинфицирующего средства (повидон-йода на основе) вокруг раны. Прекратить анестезию и не откладывайте мышь без присмотра, пока полностью просыпаются. Держите мышей одной размещались. В послеоперационном периоде продолжают следить за состоянием здоровья; при необходимости анальгетик Администрируйте. Держите животных за 4 недели до начала фиксации мозга, чтобы обеспечить соответствующие уровни экспрессии вирусного. 2. Изготовление образцов Мозг фиксации </Сильный> Приготовление закрепителя Для получения 1 л закрепителя, весят 10 г параформальдегида и добавить его в 300 мл деионизированной H 2 O. Нагревают до 55 – 60 ° С в течение ~ 10 мин при непрерывном перемешивании. Выключить огонь и добавить 7 – 8 капель 4 N NaOH. Решение должно быть ясно, в ~ 10 мин. Дать ему остыть до комнатной температуры, добавляют 150 мл насыщенного раствора пикриновой кислоты и довести его до 500 мл деионизированной H 2 O. Добавить 500 мл 0,2 М фосфатного буфера (PB). Фильтр с фильтровальной бумагой. Доведения рН до 7,4 с помощью NaOH. Охлаждают закрепитель до 6 ° С, храните его в темных стеклянных бутылках не более чем на один день при 6 ° С. Transcardiac перфузия Обезболить мышей с внутрибрюшинного введения тиопентала (120 мг / кг массы тела). Убедитесь, что животное глубоко под наркозом путем проверки вывода педали Reflех, которые должны отсутствовать. Место животное на спине на столе перфузионного с четырех конечностей связаны вниз. Открыть брюшной стенки в продольном направлении с тупым концом ножниц и сделать два дополнительных сокращений в боковом направлении вдоль хвостового границы грудной клетки, чтобы выставить диафрагму. Срежьте диафрагму и разрезать грудную стенку на osteocartilageneous границе с обеих сторон. Поднимите Хвостовой конец центральной плиты грудной стенки, содержащей грудину, чтобы разоблачить сердце. Удалить перикарда, сделать небольшой разрез в точный кончик левого желудочка признать канюлю перфузионной аппарата. С помощью тупого канюлю с внутренним диаметром 0,6 мм. Пропустите полую иглу мягко через желудочек до кончик появляется в восходящей части аорты и закрепить канюлю с зажимом. Для того чтобы кровь и perfusates к выходу из потока крови, сделать разрез в правом предсердии. Мыши обрызгивать транскардиальную с использованием перистальтического насоса при скорости потока5 мл / мин сначала с PBS (25 мМ, 0,9% NaCl, рН 7,4) в течение приблизительно 1 мин, а затем охлажденный льдом фиксаторе в течение 7 мин. После фиксации, разъединить голову мыши с ножницами, а затем порезать кожу через среднюю линию от шеи до носа. Удалите мышцы, чтобы полностью разоблачить череп. Используя острые ножницы, сделать продольный разрез через затылочной и interparietal костей, начиная от затылочного отверстия. Использование тонких пинцеты удалить эти кости, чтобы выставить весь мозжечок. Затем сделайте еще один продольный разрез через теменной и лобной кости до носовой кости и удалить их с помощью пинцета, чтобы разоблачить весь мозг. С помощью шпателя удалить мозг, не повредив его, и поместить его в ледяной 0,1 М PB. Секционирование и обрезке образцов Вырезать корональной блок примерно 5 – 6 мм с лезвиями, содержащих интересующую область. Клей его на держательvibroslicer с цианакриловым клеем. Сориентируйте блок ткани таким образом, что неокортекс сталкивается с вибрирующим лезвием. Разрез Коронарные срезы, содержащие миндалины, при 140 мкм с vibroslicer (рисунок 1А) в охлажденном льдом 0,1 М PB, и собирает их в 6-луночного блюдо в том же самом буфере. Под стереомикроскопа, отсечь область интереса (здесь медио-дорсальные paracapsular скопление КВТ см Фигура 1В) от среза. Делайте это в чашку Петри, покрытую силиконового эластомера и, заполненного 0,1 М PB, используя глазную скальпель. Убедитесь , что обрезанные блоки укладываются в отверстие проставки (примерно 1,5 мм) (рис 1В). Перемещение обрезанные блоков в раствор криозащиты (30% глицерина в 0,1 М PB) O / N при 6 ° С. 3. Высокая Замораживание давления Примечание: FRIL состоит из 6 существенных шагов (Рисунок 2): 1) быстрое замораживание с высоким давлением (при 2,300 – 2,600 бар) образца. 2) растрескивание образца. Плоскость перелома в целом соответствует центральной гидрофобного ядра замороженных мембран, разделив их на две половины мембраны листков: а половина, которая находится рядом с протоплазмы (Р-лица) и половину, которая находится рядом с внеклеточной или exoplasmic пространства (E- лицо). 3) тиражирование образца методом вакуумного осаждения платины и углерода. 4) моюще-переваривание ткани. 5) метки антител. 6) Анализ реплики с использованием просвечивающего электронного микроскопа. Получение медных носителей Примечание: Для того, чтобы быть обработаны через последовательные этапы процедуры FRIL, образцы должны быть смонтированы на металлической (золота или меди) носителей. Эти носители различаются по размеру и конструкции в соответствии с режимом трещиноватости и типа машин, используемых. Здесь мы использовали медные носители (рис 1B, Е) и шарнирной "двойной стол реплики"; (см Рисунок 3B), который при открытии производит растяжение трещины через замерзшие образца (рисунок 2). Это позволяет сохранять и копировать обе стороны сломанных образца. Польские медные носители с окалины для удаления с использованием листа замшевой кожи. Место носителей в стеклянном чайнике и чистый дважды с неионогенного детергента (рН ~ 1,5) в ультразвуковую водяной бани, а затем интенсивно промыть в проточной воде, затем деионизированной водой, а затем промыть дважды этанолом. Разрушать ультразвуком медные носители в ацетоне в течение 15 мин. Поместите носители на фильтровальную бумагу, чтобы высушить. Приложите кольцо двухсторонней ленты к медной носителя (Рисунок 1С), который будет служить в качестве удерживающего хорошо для отделан блок (холдинг носителя). Замораживание образца Примечание: Обращаться с жидким азотом с осторожностью и носить соответствующие очки. Включите высокого давления свободногоБлок Zing (рис 1F) , по меньшей мере 1,5 ч , прежде чем начать с образцом замораживания. Начните нагрев, нажав на кнопку "Воздухонагреватель", и выпекать в течение 50 мин. Заданное значение температуры воздуха до 80 ° C. Подключите баллон с азотом с морозильный блок высокого давления и нажмите кнопку "АЗОТА", чтобы заполнить внутреннюю Дьюара с жидким азотом. В "АЗОТ LEVEL" лампочка. Начало охлаждения, нажав на кнопку "охлаждение". Нажмите кнопку "IN-ДРАЙВ" кнопку, когда "АЗОТ LEVEL" гаснет. Убедитесь, что гидравлическая система перемещает поршень назад и вперед 3 раза. Нажмите кнопку "AUTO", а кнопка "АЗОТА". Как только "ГОТОВ" загорается, блок замораживания высокого давления готов к замораживанию высокого давления. Поместите обрезанную блок в отверстие двусторонней клейкой ленты (рисунок 1б) с использованием цикла из платиновой проволоки , который был расплавлен в AGдеваха пипетку. Удалите избыток криопротектора раствора с использованием фильтровальной бумаги или кистью. Примечание: Эта процедура также имеет важное значение, чтобы удалить пузырьки воздуха, которые могут образовываться вокруг ткани и которые могут привести к искажению формы ткани и / или ультраструктуры. Под стереомикроскопа, покрывают несущую удерживающую с другим носителем, таким образом, что блок ткань зажата между двумя несущими. Вставьте носитель многослойными в держатель образца блока замораживания высокого давления (рис 1D). Вставьте держатель образца в морозильный блок высокого давления (наклонить вниз) и закрепите его при помощи винтов в держателе образца. Инициировать цикл заморозки, нажав на кнопку "Джет-Авто". Работая как можно быстрее, снимите держатель образца и погрузите наконечник с жидким азотом в изолированный ящик. Погрузить кончики двух пар щипцов в жидком азоте, чтобы охладить их. Осторожно удалите юе несущей бутерброд из держателя образца и поместить его в предварительно охлажденный криопробирку. Убедитесь в том, что носители обрабатываются только с охлаждаемой жидким азотом щипцов. Криопробирок должна быть перфорирована , чтобы позволить азот вытекать из флакона (рис 1G). Повторите шаги 3.2.6 для 3.2.11, пока все нужные образцы не были заморожены. Множественные ОПЕРАТОРСКОГО сэндвичи, содержащие один и тот же тип образца можно хранить в одном флаконе. Хранить криопробирки не содержащих носителей в CryoTank до репликации (рис 1H). Рисунок 1. Подготовка ткани и морозильное высокого давления. (A) Vibroslicer используется для секции ткани.   (B) раздел мозга в результате корональных мышь , содержащая миндалины показаны бок о бок с асинхроннымОппер носитель оснащен кольцом двухсторонней ленты. Пунктирная окно указывает интересующую область, содержащую медиальной paracapsular кластер КВТ. Диаметр отверстия в двусторонней клейкой ленты составляет около 1,5 мм. (C) Инструменты для подготовки медных носителей. От верхнего левого по часовой стрелке: двухсторонняя лента, пинцет, перфоратор, медных носителей и ножниц. (D) , вставка-носителя сэндвича в держатель образца для замораживания под высоким давлением. Носителем многослойный композитный материал помещается в отверстие держателя образца. (Е) медные носители без и с кольцом двухсторонней ленты и "Монтажно-сэндвича".   (F) морозильный блок высокого давления с баком под давлением подачи жидкого азота к нему. (G) криопробирку запасти замороженных тканей. Обратите внимание на отверстия в верхнем среднем положении флакона, позволяющего газообразный азот вытекать из флакона (стрелки). <stРонг> (H) CryoTank для хранения замороженной ткани. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. 4. Замораживание-трещины и репликации Подготовка пушек электронно – лучевых Перед установкой пушки электронно-лучевые, удалите защитный экран с "дефлектора". Поместите "настройки" датчик для центровки нити в цанговый патрон через нижнюю крышку катода. Примечание: Чем больше диаметр конца датчика настройка используется для углеродсодержащего пушки в то время как меньший конец диаметр платиновых пушки. Задвиньте новую нить над датчиком до "пластинками давления" может зажимать концы нити, убедившись, что катушка нити не лежит под углом. Снимите датчик установки и вставьте угольный стержень. Зафиксируйте его, затянув сотрудничествоLLET патрон реечник испарителя, гарантируя, что высота конца стержня находится в середине второй катушки со дна. Платиновых пушки, высота конца платинового стержня должна быть в середине второй катушки нити сверху. Заменить дефлектора и вставьте оружие в блок сублимационной разрушения. Очистите пушки с песчано-бластер после использования. Рисунок 2. Иллюстрация из ключевых шагов в FRIL техники. Схема различных этапов, необходимых для подготовки и анализа реплик. (1) замораживание высокого давления ткани. (2) гидроразрыва. Во время гидроразрыва замороженной ткани, липидный бислой плазматических мембран разделяется на две половинки в гидрофобной интерфейс. Белки в плазматической мембране выделяются на либо exoplasmic (E-лицо) или протомембраны (плазменные P-лица). (3) репликации. Испарение углерода (С) ловушки липидов и белков на поверхности излома ткани. Материал покрыт 2 нм платина / углерод для затенения под углом 60 °, а затем с другим 15 нм углеродного слоя, который укрепляет структуру реплики (С-слой Pt-затенение). (4) Растворение. Ткань не улавливаются реплики мембраны затем солюбилизировали с SDS-раствором. (5) Этикетировочное. Белки интерес могут быть визуализированы на реплику с использованием комплекса, сделанный из специфических первичных антител (первичная Ab) и вторичными антителами (вторичный AB), конъюгированных с золотой частицей (Au). Использование различных размеров частиц золота позволяет обнаружить более чем одного белка на той же самой реплики. (6) После того, как иммунноокрашивания, точные копии собираются на медной сетки сетки и проанализированы с помощью просвечивающего электронного микроскопа при 80 -. 100 кВ Пожалуйста КлиКK здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Настройка блока замораживания разрушения Включите блок замораживания трещины (рис 3А), повернув на отводе 1. Подробное описание процедур замораживания-разрушения и репликации, смотрите инструкцию по эксплуатации , предоставляемых производителем. Перед охлаждением устройства сублимационной излом, выпекать из всей системы охлаждения блока с теплым воздухом. Нажмите кнопку «оттепели» в 010 устройстве MTC (блок контроля температуры) (рис 3A) , и пусть пекут из процесса в течение 45 мин. Включите вакуумный станцию. Блок сублимационной излом обычно работает в вакуумном диапазоне ~ 10 -6 – 10 -7 мбар. Заполнить резервуар с азотом и подключить его к блоку сублимационной разрушения. Убедитесь, что держатель клапана сухой, а также очистить запись резервуара перед вставкой держателя клапана (влажность может помешать VACUUм и индикация N 2 наполнение резервуара). Начало охлаждения путем установки температуры до -115 ° С. Охлаждение занимает около 45 мин. Вставьте пушки электронно-лучевые и регулировки тока и напряжения для достижения следующих параметров для испарения: Углеродные пистолет: вращение на, положение 90 °, скорость накопления углерода 0,1 – 0,2 нм / сек Углерод-платиновый пистолет: вращение прочь, положение 60 °, скорость накопления 0,06 – 0,1 нм / сек Примечание: Если пистолет используется в первый раз после того, как обмен на углероде или платины стержня, деаэрации в течение 3 мин перед использованием. Гидроразрыв и репликации Вставьте замороженные несущие-сэндвичи в двойной стол реплики убедившись все манипуляции производятся в жидком азоте. Передача двойной стол реплики в сосуд Дьюара и закрепить его на сцену приемника образца под углом 45 °. Уровень жидкого азота всегда должна быть выше двойной таблицы реплик. </li> Возьмите двойной стол реплики с таблицей манипулятором и вставьте его в блок сублимационной разрушения на холодную стадию. Подождите примерно 20 минут, чтобы дать температуре двойной таблицы реплики, чтобы приспособиться к -115 ° C. Убедитесь , что вакуум ниже 10 -6 мбар и температуре -115 ° С. Раздробить ткани путем ручного вращения против часовой стрелки, колеса, соединенного с бандажом, расположенной над столом двойной реплики. Когда пелена поворачивается, он заставляет двойную таблицу реплик, чтобы открыть, гидроразрыва ткани. Нажмите кнопку "Высокое напряжение" в (блок управления электронным лучом испарения) +030 устройство EVM блока замораживания разрушения (рис 3А). Повторные открытые поверхности излома ткани (рис 3C) путем испарения углерода (ротационный) с помощью электронно – лучевой пушки , расположенной под углом к толщиной 5 нм 90 °, а затем однонаправленное Shadoкрыло с платиной-на-угле под углом 60 ° по отношению к толщине 2 нм. И, наконец, применить толщиной 15 нм слой углерода с углом 90 ° (вращение). Используйте следующие параметры для испарения: Первый углерода: вращение на, положение 90 °; Скорость 0,1 – 0,2 нм / сек; 5 нм Второй углерод-платиновый: положение 60 °; Скорость 0,06 – 0,1 нм / с; 2 нм 3-й углерод: вращение на, положение 90 °; Скорость 0,3 – 0,5 нм / с; 15 нм Удалите реплицировать образцы из блока сублимационной разрушения и передавать их на керамическую 12-луночного планшета (рисунок 4A) , заполненный TBS (Трис – солевой буфер, рН 7,4). Используя катанку платиновую петлю, удалите реплицированную ткани из образца носителя (рис 4а). Повторите шаги 4.3.1 4.3.10, пока все образцы не были воспроизведены. <b г /> Рисунок 3. Замораживание-гидроразрыва и репликации. (А) Устройство сублимационной разрушения. Машина содержит несколько блоков управления и монитор. Образцы вводят в камеру через входное отверстие на левой стороне камеры. Нагнетанием контейнер с жидким азотом соединен с блоком сублимационной разрушения для охлаждения ступени. Изображения ниже показывают увеличенные виды двух блоков (СКП 010 и MDC 010) и монитора отображаются параметры во время испарения второго слоя углерода.   (В) был открыт (слева) и закрытые (справа) вид двойной таблицы реплик. «Несущей-сэндвичи" вставляются в пазы таблицы (указаны стрелками). Стрелковое оружие предотвратить "носитель-сэндвичи" от падения во время манипуляций. (C) ломаются и реплицировать образец. Реплики появляются как тонкие черные пленки на верхней части раздробленной ткани.53 / 53853fig3large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. SDS-переваривание реплики Передача реплики в стеклянную пробирку емкостью 4 мл, заполненную 1 мл SDS-буфера пищеварения (2,5% лаурилсульфата натрия, 20% сахарозы в 15 мМ Трис, рН 8,3). Дайджест в течение 18 часов при 80 ° C при встряхивании (45 ходов / мин). Передача репликами в новую пробирку, заполненную ДСН-сбраживания буфера и хранят при комнатной температуре. 5. иммунноокрашивания ПРИМЕЧАНИЕ: Все инкубацию проводят при комнатной температуре при осторожном встряхивании, для инкубирования с антителами, за исключением. Вымойте реплику в течение 10 минут в свежем буфере SDS-переваривания. Промывают реплику один раз с 2,5% БСА (бычий сывороточный альбумин) в TBS в течение 5 мин, а затем 3 х 10 мин с 0,1% БСА в TBS. Блок неспецифические сайты связывания в TBS с 5% BSA в течение 1 часа. Применение первичного антиорганы разводят в 2% БСА-TBS. Выполните инкубацию в 30 мкл капли (фиг.4В) во влажной камере при 15 ° С в течение 72 ч (фиг.4С). Для этого исследования процесса как точные копии из раздробленной ткани. Выдержите в одну реплику с морской свинки поликлональных антител, выработанном против аминокислоты 717 – 754 мыши GluR1 общей для всех субъединиц АМРА-R (разведение: 1: 200) или мышиных моноклональных антител, выработанных против рекомбинантного слитого белка, охватывающих аминокислоты 660 – 811 из NR1 субъединицей рецептора NMDA-R (разведение: 1: 500) и поликлональное антитело кролика, выработанном против зеленого флуоресцентного белка (разведение: 1: 300). Выдержите другой реплики с поликлональное антитело кролика, выработанном против синтетического пептида, соответствующего аминокислотам 384 – 398 мю-опиоидных рецепторов крысы (разбавление: 1: 500). Промыть в TBS с 0,05% бычьего сывороточного альбумина (3 х 5 мин.). Применение вторичных антител. Для этого исследования Uсебе золото (5 нм для ионотропных рецепторов глутамата, 10 для μ-опиоидных рецепторов и / или 15 нм для ChR2-YFP) конъюгированные антитела, разбавленные в TBS с 2% BSA. Развести вторичными антителами 1:30 и инкубировать в капле 30 мкл при 15 ° CO / N. Вымойте 3 х 5 мин в 0,05% BSA-TBS при комнатной температуре. Вымойте 2 х 5 мин в сверхчистой воде. Маунт реплики на 100-линии параллельные брусья сетки формвар покрытием (рис 4D). 6. Анализ реплики Реплики изображение с помощью просвечивающего электронного микроскопа (ПЭМ) при 80 или 100 кВ. Приобретайте цифровые изображения с помощью CCD (ПЗС) камеры. Offline, найти соответствующие области на изображениях с обеих репликах с использованием ориентиров (Рисунок 4E). Анализ цифровых изображений с использованием изображения J. Определение постсинаптического площадь и число частиц immunogold-меченого, направленных против рецептора анализируемого. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-страница = "1"> Рисунок 4. иммунноокрашивания реплики. (A) Инструменты для обработки и мытья реплик. Керамический 12-луночного планшета (справа вверху) и 2 вида стеклянных пипеток (вверху слева). Стеклянная пипетка с круглым наконечником (внизу слева) используется для передачи реплики, и пипетка с платиновым стержнем (внизу в центре) используется, чтобы развернуть точные копии. Копия в промывочном буфере (внизу справа). (Б) иммунноокрашивания репликами осуществляется в виде капель (30 мкл) , размещенные на небольшой кусочек парафином в лунку для культуры ткани 6-луночный планшет. Обратите внимание, что копия покрыта каплю буфера, содержащего антитела. Для того, чтобы предотвратить испарение, смоченного папиросную бумагу установлен вокруг внутреннего края колодца. (C) Инкубатор для стадии иммунноокрашивания. Инкубацию проводят при 15 ° С. (D) Копия установленный на формвар покрытием 100-линия, параллельная бар сетки. (Е) Низкая увеличением микрофотографии от пары реплик. Пунктирные квадраты указывают три типичных ориентиры для определения местоположения в соответствующих реплик. Шкала бар: 10 мкм. Все данные представлены в виде среднего значения ± СЭМ Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.