Integration von Nass- und Trocken Bench Prozesse werden so optimiert Gezielte Next-Generation Sequenzierung von Low-Qualität und Low-Menge Tumorbiopsien
Summary
An integrated system for targeted next-generation sequencing of oncology specimens is described. This cross-platform system is optimized for low-quality and low-quantity tumor biopsies, accommodates low DNA inputs, includes well-characterized multi-variant controls, and features a novel variant caller that is informed by quantitative pre-analytical quality control measures.
Abstract
Alle der nächsten Generation Sequenzierung (NGS) Verfahren umfassen Tests auf der Laborbank ( "wet bench") durchgeführt und Daten-Analysen der Bioinformatik-Pipelines durchgeführt unter Verwendung von ( "Trockenbank"). Beide Elemente sind für eine genaue und zuverlässige Ergebnisse zu erzeugen, die für klinische Labors besonders kritisch sind. Gezielte NGS-Technologien haben in zunehmendem Maße für die in der Onkologie-Anwendungen gefunden Voraus Präzision Medizin Ziele zu helfen, aber die Methoden beinhalten oft getrennt und variable nassen und trockenen Bank Workflows und unkoordiniert Reagenz-Sets. In diesem Bericht beschreiben wir ein Verfahren zur Sequenzierung herausfordernde Krebsproben mit einem 21-Gen-Panel als Beispiel eines umfassenden gezielten NGS-System. Das System integriert funktionelle DNA-Quantifizierung und Qualifizierung, Einrohr-Multiplex-PCR-Anreicherung und die Bibliothek Reinigung und Normalisierung analytisch verifiziert, Single-Source-Reagenzien mit einem eigenständigen Bioinformatik Suite.Als Ergebnis erfordert eine genaue Variante von geringer Qualität und Low-Menge in Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE) und Feinnadel (FNA) Tumorbiopsien erreicht werden kann. Das Verfahren kann bei Krebs vorkommenden Varianten von einem Eingang von 400 amplifizierbare DNA Kopien und ist modular aufgebaut aufzunehmen neues Gen Gehalt routinemßig beurteilen. Zwei verschiedene Arten von analytisch definierten Kontrollen liefern Qualitätssicherung und zum Schutz von Call-Genauigkeit mit klinisch relevanten Proben. Ein flexibles "tag" PCR-Schritt bettet plattformspezifischen Adapter und Indexcodes Probe Strichcode- und Kompatibilität mit gängigen Benchtop NGS Instrumente zu ermöglichen. Wichtig ist, dass das Protokoll rationalisiert und kann 24 Sequenz-ready-Bibliotheken in einem einzigen Tag produzieren. Schließlich verbindet der Ansatz nassen und trockenen Bank Prozesse durch die präanalytische Proben Ergebnisse der Qualitätskontrolle direkt in die Variante enthält Algorithmen Aufruf Mutation Erkennungsgenauigkeit zu verbessern und zu differenzieren falsch-negative und indeterminate Anrufe. Diese gezielte NGS-Methode verwendet Fortschritte sowohl in der Wetware und Software hoch Tiefe, Multiplex-Sequenzierung und empfindliche Analyse von heterogenen Krebsproben für diagnostische Anwendungen zu erreichen.
Introduction
Präzisions Medizin beruht auf der Individualisierung von diagnostischen und therapeutischen Möglichkeiten für die Patienten. Das Versprechen von maßgeschneiderten Behandlungen ist eine direkte Folge einer verbesserten Verständnis von Krankheitswege, die die Verknüpfung der molekularen Diagnostik und gezielte Therapeutika informieren können. Zum Beispiel erhöht die Verwendung von molekular-zielgerichtete Therapien von 11% auf 46% von 2003 bis 2013 1 und Anti-Krebs – Medikamente wie Vemurafenib und crizotinib sind mit diagnostischen Begleittests der FDA genehmigt. Mit seiner Fähigkeit, Low-Fülle-Sequenz Ziele über hoch Multiplex-Sample-Sets, um genau zu erholen, hat Next-Generation-Sequencing (NGS) als Methode der Wahl entstanden für genetische Abweichungen im Zusammenhang mit Krebs zu bewerten und molekulare Ziele für Präzisionsmedizin zu identifizieren.
Die häufigsten soliden Tumor-Biopsien für molekulare Tests umfassen Formalin-fixierte, in Paraffin eingebettete (FFPE) und Feinnadel (FNA) Specimens. Diese Proben sind behaftet mit niedrigem Menge und / oder minderwertige Nukleinsäuren, die genaue NGS Assessments 2-5 herauszufordern. Aktuelle kommerzielle NGS-Methoden für die Analyse dieser Proben auf einem Flickenteppich von verschiedenen Reagenzien, Protokolle basieren, und Informatik-Tools, die bewegliche Ziele der kontinuierlichen Verbesserung darstellen. Beispielsweise Änderungen in Assay Chemien und / oder Software eingetreten alle 1-2 Monate für die am häufigsten verwendeten gezielte NGS kits 6. Diese Instabilität spiegelt einen Mangel an Kohärenz bei der Konstruktion und ein einheitliches NGS-System für anspruchsvolle Probentypen, insbesondere für Krebs-Tests zu überprüfen und stellt eine unzumutbare Belastung für Laboratorien zusammenhängende Protokolle zu entwickeln, die von der Probe-zu-Ergebnisse optimiert sind. Tatsächlich markiert eine aktuelle Umfrage von NGS-Benutzer, die Schwierigkeiten dieser "sich rasch verändernden" Technologien, zusammen mit den Anforderungen für die etablierten, medizinisch verwertbare Inhalte, verschanzt Bioinformatik Know-how, ein solidified und integriertes Verfahren , die schnell umgesetzt werden können, und optimierte Workflows und vereinfachte Protokolle , die 7 Training on-the-Job erleichtern. In diesem Artikel wird ein umfassendes System für die gezielte NGS beschrieben, die diese Lücken behebt.
Die vorgestellte Methodik integriert alle Verfahrensschritte von präanalytischen zu post-analytische auf nassen und trockenen Bänke, die Genauigkeit, Empfindlichkeit und Zuverlässigkeit der Ziel Quantifizierung und zum Nachweis für NGS von klinisch relevanten Krebs-Gen-Loci zu verbessern. Dieser Ansatz beginnt mit der Quantifizierung der "funktionellen" DNA 4 DNA – Qualität beurteilen zu können , führen Eingang in die PCR – Anreicherungsschritt, und Schutz vor falsch-positiven Anrufe, die von der Abfrage von sehr niedrigen Vorlage Kopien entstehen können. Ein Single-Tube-Multiplex-PCR bereichert dann für 46 Loci in 21 Krebs-Gene nur 400 amplifizierbare DNA-Kopien, gefolgt durch den Einbau von plattformspezifischen Sequenzen für NGS usin mitg gemeinsame Instrumente Desktop-Sequenzierung. Bibliotheken werden gereinigt, um ein einfaches magnetisches Kügelchen Prozedur und mit einem neuen, Kalibrierung freien qPCR-Assay quantifiziert. Eine eigenständige Bioinformatik-Suite, informiert durch DNA-Probe QC Ergebnisse Anruf Leistung zu verbessern, stellt die Sequenzanalyse folgende NGS. Wir präsentieren Daten, die diese Systeme Ansatz für die gezielte NGS mit Basensubstitutionsmutationen zu offenbaren, Insertion / Deletionen (indels), und Nummer des Exemplars Varianten (CNVs) in geringer Qualität und Low-Menge Tumorbiopsien wie FFPE und FNA Proben und Lauf Kontrollen.
Protocol
Representative Results
Discussion
NGS Technologien haben Erwartungen umdefiniert 9 die molekularen Profilen von Tumorbiopsien in klinischen Einrichtungen zur Abfrage. Eine Reihe von gezielten NGS Platten wurden als Forschungstechnologien, Labor entwickelten Tests entwickelt und im Handel erhältliche Produkte und kundenspezifische Panels für 3,5,10-15 mehrere Arten von klinischen Proben zu bewerten. Berichte von mehreren Studien haben den Wert von NGS als empfindliche und spezifische klinisches Werkzeug für den Nachweis von genomischer Veränderungen 3,10-12,14 demonstriert. Noch Studien haben gezeigt , auch das Risiko von Artefakten , die falsch-positive Ergebnisse aus anspruchsKrebsBiopsien wie FFPE – Proben 2-5,12,14 verursachen können. Darüber hinaus haben die jüngsten Publikationen Raten hohe Ausfall für NGS hervorgehoben Onkologie mit Proben 16 und falsch-positive Gespräche mit kommerziellen gezielte NGS Platten , die 12 durch die Verwendung von Low-Input – DNA noch verschärft werden. Als Ergebnis einige laboraTories haben entweder geändert oder zusätzliche Kontrollen und Salden zusätzliche Leistung zu kommerziell erhältlichen gezielte NGS – Technologien zu verbessern, oft die Genauigkeit zu gewährleisten oder die Ergebnisse bestätigen aus der bioinformatischen 5,10,11 analysiert.
Der 21-Gen – Panel (Abbildung 2) wurde als zielgerichtete Inhalte für ein umfassendes NGS System entwickelt , evidenzbasierte, umsetzbare Mutationen in schwierigen Probentypen wie FFPE und FNA Tumorbiopsien zu befragen. Der Workflow hat eine Reihe von Vorteilen: 1) Konsistenz , indem sie einheitliche Amplikon Abdeckung (3 und 4, Tabelle 3); 2) die Einfachheit der Nutzung durch die Bereitstellung vorformulierten, optimierte Reagenzien-Sets, und Vereinfachung der Bioinformatik Anforderungen; 3) Effizienz durch den Workflow zu straffen und die Anzahl der Pipettierschritte reduziert im Vergleich zu anderen kommerziellen NGS-Methoden; und 4) Genauigkeit durch eine DNA-QC-Test für die Beurteilung der Endverstärker EinbeziehungLage , die DNA – Kopienzahl auf akzeptable Vorlage sicherstellen und stochastischen Schwankungen in der Variantenerkennung 4 zu vermeiden. Die Integration der präanalytischen QC-Daten mit der bioinformatischen Auswertung ermöglicht niedrige Eingänge von FFPE DNA. Dies wurde durch die Ausbildung einen Entscheidungsbaum-Algorithmus unter Verwendung von verschiedenen funktionellen Kopien der DNA-Eingabe über 400 FFPE Proben mit unabhängigen Maßnahmen der Wahrheit erreicht, und die Einbeziehung dieses Algorithmus in die bioinformatischen Software. Als Ergebnis vergleicht der empfohlenen Eingang 400 amplifizierbare Kopien typischerweise äquivalent zu ~ 5-20 ng von FFPE DNA, vorteilhaft mit anderen Methoden 10-12, einschließlich Hybridisierungs-Anreicherungs wo ~ 250 ng DNA FFPE 17,18 empfohlen . Obwohl die Technik zur Verwendung auf einer MiSeq Plattform beschrieben wird, kann es durch die Verwendung von PCR-Primern Tag mit gerätespezifischen Adaptern modifiziert werden, um die Sequenzanalyse auf anderen NGS-Plattformen ermöglichen.
Mehrere Schritte sind entscheidend den Erfolg sicherzustellendes Verfahrens. Die präanalytische QC-Test bestimmt die amplifizierbare Kopienzahl von DNA und Berichte funktionellen Hemmung. Wenn jedoch weniger als 400 amplifizierbaren DNA – Kopien in der PCR Anreicherungsschritt verwendet werden, besteht ein erhöhtes Risiko eines falsch-negativen Anruf von Proben mit niedriger Abundanz Mutationen (Abbildung 6). Außerdem muss darauf geachtet werden während der Bibliotheks Reinigung zu verhindern Übertrocknung der magnetischen Beads in den Wasch- oder Elutionsschritte genommen werden. Darüber hinaus ist erfolgreich Bibliothek Quantifizierung über die genaue Verdünnung von Bibliotheks-DNA in hohem Maße abhängig. Für das beste Ergebnis ergibt sich die Differenz der qPCR für die Probe-Bibliothek (CQ FAM) im Vergleich zum LQ Standard (Cq VIC) sollte ≤3.3 Cq sein. Wenn die Differenz größer als 3,3 Cq, Wiederverdünnung und Testen der Probe wird empfohlen. Obwohl eine ausgezeichnete Korrelation zwischen dieser Wettbewerbs qPCR-Methode und kommerzielle Kits, die bieten absolute Quantifizierung unter Verwendung einer Standardkurve beobachtetEine der Bibliothekseintrag in den klonalen Amplifikationsschritt relativ zu anderen Methoden Offset kann notwendig sein, eine optimale seeding Dichte zu erreichen.
Einige Krebsproben sind eine Herausforderung vor allem wegen der Inhibitoren zu sequenzieren, die nach der DNA-Isolierung bestehen. Um diese Proben vor der Bibliothek Vorbereitung identifizieren, erkennt der qPCR QC-Test auch Amplifizierungshemmung durch eine exogene Vorlage einschließlich, die als sowohl eine interne Kontrolle und ein Wächter für die funktionelle Hemmung dient. Ein Beispiel ist in Abbildung 3 , in dem ein Melanom DNA Probe versagt stellte die QC Hemmung metric vor der Sequenzierung zu passieren und dann versagt , eine Bibliothek zu erzeugen , die sequenziert werden konnten. Das Scheitern war wahrscheinlich eine Folge von Melanin Kontamination, einem bekannten PCR-Inhibitor, aus der FFPE DNA-Isolierung Schritt übertragen. Die Proben, die durch den QC-Test identifiziert werden, bei Gefahr für die Amplifikation Versagen sein kann durch einen zusätzlichen Reinigungsschritt t geborgen werdeno entfernen potentielle Inhibitoren.
Die gezielte 21-Gen-Panel konzentriert sich auf evidenzbasierte Gen-Hotspots und bietet ein komplettes System mit optimierten Reagenzien und Kontrollen für die DNA-QC, NGS und Bioinformatik-Software, die von präanalytischen "funktional" DNA-Quantifizierung Ergebnisse informiert wird. Das Verfahren genau erkennt Basensubstitutionsmutationen und indels von low-input DNA und stellt ein Beispiel eines NGS System mit der Option Panel Inhalt zu erweitern, zusätzliche Varianten wie CNV zu erkennen und zur gezielten RNA-Sequenzierung angepasst werden.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Annette Schlageter für die Überprüfung des Manuskripts. Diese Arbeit wurde teilweise durch Gewährung CP120017 von der Cancer Prevention Research Institute of Texas (: GJL PI) unterstützt.
Materials
| 2x Quantidex Master Mix | Asuragen | 145345 | |
| Quant Primer Probe Mix | Asuragen | 145336 | |
| Inhibition Primer Probe Mix | Asuragen | 145344 | |
| ROX | Asuragen | 145346 | |
| Diluent | Asuragen | 145339 | |
| DNA Standard (50) | Asuragen | 145340 | |
| DNA Standard (10) | Asuragen | 145341 | |
| DNA Standard (2) | Asuragen | 145342 | |
| DNA Standard (0.4) | Asuragen | 145343 | |
| 2X Amplification Master Mix | Asuragen | 145348 | |
| Pan Cancer Primer Panel | Asuragen | 145347 | |
| Pan Cancer FFPE Control | Asuragen | 145349 | |
| Pan Cancer Multi-Variant Control | Asuragen | 145350 | |
| Library Pure Prep Beads | Asuragen | 145351 | |
| Wash Buffer | Asuragen | 145352 | |
| Elution Buffer | Asuragen | 145353 | |
| 2X LQ Master Mix | Asuragen | 145358 | |
| LQ Diluent | Asuragen | 145354 | |
| LQ Positive Control | Asuragen | 145355 | |
| LQ Standard | Asuragen | 145356 | |
| LQ Primer / Probe Mix (ILMN) | Asuragen | 145357 | |
| LQ ROX | Asuragen | 145359 | |
| Index Codes (ILMN) – Set A, AIL001 – AIL048 (48) | Asuragen | 150004 | |
| AIL001 – AIL048 (48) | |||
| Index Codes (ILMN) – Set B, AIL049 – AIL096(48) | Asuragen | 150005 | |
| AIL049 – AIL096(48) | |||
| 2X Index Master Mix | Asuragen | 145361 | |
| Read 1 Sequencing Primers | Asuragen | 150001 | |
| Index Read Sequencing Primers | Asuragen | 150002 | |
| Read 2 Sequencing Primers | Asuragen | 150003 | |
| Sequencing Diluent | Asuragen | 145365 | |
| Illumina MiSeq | Illumina | ||
| MiSeq Reagent Kit v3 (600-cycle) | Illumina | MS-102-3003 | |
| MiSeq Reagent Nano Kit v2 (300-cycle) | Illumina | MS-103-1001 | |
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | |
| Magnetic Stand-96 (Or equivalent device) | Ambion | AM10027 | |
| Quantidex Reporter Software | Asuragen |
References
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