¿Por qué importa la cuantificación: Caracterización de fenotipos en el<em> Drosophila</em> Larval unión neuromuscular

1. Preparación Experimental Nota: Las disecciones y procedimientos inmunohistoquímicos en las secciones 2 y 3 se llevan a cabo de acuerdo con las referencias 3-6, pero con modificaciones. Preparar solución salina tamponada con fosfato 1x (PBS) y PBS que contenía 0,1% de Triton X-100 (PBT). Mantenerlos en hielo. Preparar el fijador de Bouin (15 Ácido pícrico: 10 El formaldehído: 1 Ácido acético glacial). Hacer de este reactivo nuevo. Seleccionar pasadores minutien de acero inoxidable limpia y unas pinzas finas. Preparar placas de disección que contienen un disco de Sylgard en una placa de Petri de 5 cm. 2. Disección del tercer estadio larvario NMJs Escoja errante larvas de tercer estadio de un vial o una botella con un pincel fino y colocarlos en una placa de Petri que contiene 2 cm PBS a 4ºC para lavar la comida residual de distancia. Coloque una larva en la parte superior de la superficie Sylgard de la placa de disección y asegurarse de que es positioned con su lado dorsal de modo que los dos tubos traqueales longitudinales son visibles en la parte superior. Usando las pinzas para sujetar el pasador, perno de la larva hacia abajo en su extremo anterior, directamente debajo del gancho de la boca. Estirar la larva a cabo tanto como sea posible y el pin de su extremo posterior hacia abajo. Añadir una cantidad suficiente de solución salina PBS para llegar a las paredes de la placa y sumergirse por completo la larva. Repetir el procedimiento de los pasos 2.1 a 2.3 para otras larvas del mismo genotipo. A 5 cm Petri placa plato único disección puede acomodar fácilmente hasta 8 larvas. El uso de las tijeras micro-disección, levante ligeramente la cutícula dorsal y hacer una pequeña incisión horizontal en el extremo posterior cerca de la espiga. Inserte tijeras en la incisión, corte la larva todo el camino hasta el extremo anterior a lo largo de la línea media entre las dos secciones longitudinales de la tráquea. Asegúrese de que los cortes de la línea media son lo suficientemente superficial para pasar sólo a través de la cutícula y para evitar cortar a través de los músculos deel lado ventral. En cada extremo, cortar dos muescas en los lados izquierdo y derecho. Abra el filete mediante la colocación de dos pasadores a ambos lados de la incisión anterior. Repita lo mismo con el extremo posterior. Al colocar los pines, asegúrese de difundir la pared del cuerpo aparte. Limpiar los órganos internos utilizando fórceps y solución salina PBS. Deje el sistema nervioso central intacto. estirar suavemente la larva con los pernos de las esquinas hasta que esté completamente estirada, pero asegúrese de que los músculos no se rompen durante este proceso. Repetir el mismo procedimiento para la disección de las larvas de otros en la misma placa de disección. Lavar con solución salina PBS tres veces para eliminar todos los órganos internos. Vuelva a colocar la PBS con fijador de Bouin y dejar a temperatura ambiente durante 10 minutos. Lavar varias veces con PBT. Retire los pasadores con cuidado y transferir todos los preparativos, que ahora son bastante rígido, en un tubo de 1,5 ml de microcentrífuga de inmuno-tinción. La tinción inmunohistoquímica 3. de Drosophila NMJs con anticuerpos específicos para los músculos y mionúcleos enjuagar rápidamente los filetes de larvas en PBT. Bloquear las preparaciones mediante incubación con 10% de suero normal de cabra (NGS) en PBT durante 2 horas con agitación constante. Incubar un conjunto de NMJs disecados en PBT que contiene 5% de NGS y un anticuerpo de conejo anti-lamina (a una concentración de 1: 500) y con un anticuerpo anti-DVAP conejillo de indias (a una concentración de 1: 500) durante 2 horas a temperatura ambiente o a 4 ºC durante la noche. El anticuerpo anti-DVAP tiñe los músculos estriados, mientras que la tinción anti-lamin detecta el contorno de mionúcleos. Lavar una vez con rapidez en PBT para eliminar los anticuerpos en exceso. Lavar en PBT durante 2 horas, cambiando el PBT tampón cada 15 minutos. Se incuban las muestras en PBT que contiene 5% NGS y anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia a 1: 500 dilución durante 2 horas a temperatura ambiente. Las mismas muestras cun ser sometidos a tinción con múltiples anticuerpos al mismo tiempo si se usan anticuerpos secundarios conjugados con diferentes cromóforos. Eliminar los anticuerpos secundarios y lavar en PBT durante 2 horas, cambiando el PBT tampón cada 15 minutos. Para teñir el interior de los mionúcleos lavar las muestras tres veces con PBS y proceder como sigue: Añadir el marcador nuclear TO-PRO-3 a una dilución de 1: 1000 en PBS y se incuba durante 20 min con agitación constante. Este marcador se utiliza en este estudio, pero cualquier otro marcador nuclear disponible en el mercado puede ser utilizado también. Lavar rápidamente tres veces en PBS antes de montar. 4. Las muestras de montaje en las diapositivas Recoger las muestras con una pinza del tubo de 1,5 ml de microcentrífuga y las ponen sobre un portaobjetos de procesamiento. Mediante el uso de tijeras micro-disección, corte la cabeza y la cola de los filetes y mantener su superficie interna hacia arriba. preparar THe diapositiva de montaje envolviendo alrededor de tres tiras de cinta de celulosa en cada lado de un portaobjetos limpio a una distancia de aproximadamente 1 cm entre sí. Una vez que el cubreobjetos se coloca en la parte superior de las dos tiras, una brecha se generará que evitar el aplanamiento de las muestras. Esto es crucial si las representaciones de volumen tridimensionales de las estructuras deben ser hechos. Ponga una pequeña gota de aproximadamente 20 l de medio de montaje en el medio de la corredera de montaje entre las tres tiras de cinta de celulosa. Después de la difusión del medio de montaje con pinzas limpias, arrastrar las larvas diseccionado a la diapositiva de montaje en el medio de montaje, manteniendo la superficie interna hacia arriba. Trate de montar en filas de cuatro o cinco. deje caer suavemente una hoja de la cubierta en la parte superior de la corredera de montaje y asegurarse de que no se generan burbujas de aire. Sellar la diapositiva con esmalte de uñas transparente. Deje que las muestras se sequen durante al menos 10 minutos antes de la proyección de imagen. 5. Configuración Confocal de Imagen Nota: Las imágenes que se presentan en este estudio se tomaron usando una unidad confocal Nikon A1R integrados en un Ti: E microscopio invertido. Sin embargo, cualquier microscopio confocal con un mínimo de unidades 3 de láser disponibles en las regiones de longitud de onda de 488 nm, 561 nm y 642 nm y un sistema de detección 3 de canal es adecuado para este propósito. Encender el detector de rayos láser, unidad, bulbo de mercurio, el controlador etapa, microscopio y el PC. Iniciar el software de control y asegurar la diapositiva en el soporte de la platina. Para hacer más rápida de imágenes, seleccionar y marcar todas las regiones de interés (ROI) en la muestra utilizando un objetivo 20X. Con cuidado, gire la pieza de nariz a la lente objetivo 60X mayor aumento (60X Plan de Apo VC / NA 1,4 ACEITE). Coloque una gota de aceite de inmersión sobre la lente objetiva y seleccione una de las ROI marcada desde la ventana de visión general XYZ en el equipo. Comience de imágenes que utiliza las siguientes configuraciones ópticas: Seleccione el primer espejo dicroico: 405/488/561/640. Seleccione 488 nm láser con filtro de emisión de 525/50 nm en el canal 1, 561 nm láser con filtro de emisión de 595/50 en el canal 2 y el láser de 642 nm con filtro de paso largo de 650 nm en el canal 3. Utilice los siguientes parámetros de escaneo antes de iniciar la adquisición de imágenes: Seleccionar escáner Galvano; dirección de exploración: una forma; Velocidad de escaneado: 0,5 cuadros por segundo. Seleccione la serie de canales para evitar canal de derrame. Ajustar el tamaño del agujero de alfiler a 1 unidad aireado. Escanear y ajustar la potencia del láser, el aumento de la detección y compensar adecuadamente para cada canal para evitar la saturación de píxeles y nivel de fondo. Adquirir z-pilas utilizando voxel tamaño de 0,2 x 0,2 x 0,5 m 3 para todas las regiones de interés y los preparativos de diapositivas. Si las imágenes van a ser sometidos a deconvolución a continuación, establecer el tamaño del voxel a 0,06 x 0,06 x 0,15 m 3. Guardar imágenes en formato de formato de archivo o .ics .nd2. 6. Cálculo de la distancia entre núcleos dentro estriado60; Músculos por el método del Análisis de vecinos más próximos Para este análisis, utilizar confocal de imágenes que muestran los músculos del cuerpo de pared larvas teñidas con anticuerpos DVAP para visualizar los músculos y con anticuerpos lamina y un marcador nuclear para resaltar los núcleos. Para estimar la distancia más cercana entre los núcleos, utilizar Puntos de medición dentro del módulo MeasurementPro del software de análisis de imágenes (por ejemplo, Imaris). Otras aplicaciones de software similares para el análisis de imagen se puede utilizar para los mismos fines. Abrir las imágenes confocal. Para iniciar, haga doble clic en el icono del software. Arrastrar y soltar las imágenes confocal z-stack en la Arena. Haga doble clic en las imágenes para abrir automáticamente en la vista de superar, bajo el icono de la barra de herramientas del menú . La vista Superar tiene tres paneles principales del espacio de trabajo: Área, Mostrar objeto y el objeto Propiedades del área. Crear un volumen prestado tRes de imagen del canal haciendo clic en el icono del menú Vista 3D . Haga clic en el icono Agregar nuevo Puntos de Medición desde el Objetos barra de herramientas y siga el asistente de creación de objetos que aparece en Propiedades del área. Desde el asistente de creación de seleccionar la pestaña Editar primero y luego el canal específico. Seleccione el marcador nuclear o el canal de lamina para resaltar los núcleos. Mueve el puntero al modo Seleccionar pulsando la pestaña Esc en el teclado. Ajustar el tamaño de la caja del cursor 3D con la rueda del ratón para contener un núcleo dado en la imagen. Añadir un punto de medición manteniendo pulsada la tecla Shift y haga clic izquierdo del ratón sobre el mismo núcleo. Añadir el segundo punto en un núcleo cercanas en el mismo músculo mediante la repetición de los pasos anteriores. Se traza una línea automáticamente entre los dos puntos y la distancia medida entre se muestran los dos núcleos. La distancia entre los dos núcleos se registra ahora como una variable estadística en el objeto Propiedades del área bajo la etiqueta de datos Estadísticas> detallada> Distancia. Repetir el procedimiento de los pasos 6.6 a 6.10 para todos los núcleos que rodean un núcleo dado. De Estadísticas> Datos detallada> Distancia mostrando todos los puntos de medición recogidos, seleccione la distancia más corta. Al hacer clic en las estadísticas de exportación en la ficha Pantalla a Archivo disponible con el objeto Propiedades del área, los datos se guardarán en una hoja de cálculo. Repita el mismo procedimiento para los otros núcleos circundantes y para un número seleccionado de las fibras musculares por genotipo. Utilizando los datos exportados a un archivo de hoja de cálculo, calcular la distancia más corta media (D ave) para todo el número M de los músculos utilizando la siguiente ecuación: OAD / 53821 / 53821eq1.jpg "/> Di es la distancia más corta al núcleo vecino para un núcleo dado i, donde i varía de 0 a N y N es el número de núcleos analizados por músculo. La suma de los valores de j = 0 para j = m indica el número M de los músculos analizados. Como alternativa, utilice Asistente de creación de manchas y manchas de manchas Distancia mínima para estimar la distancia media al núcleo vecina más cercana. Para esto, se necesita un módulo de extensión de Matlab. Haga doble clic en una imagen específica en la imagen 3D de un volumen Arena y se mostrará en el área de visualización. Haga clic en el icono de creación de objetos y añadir nuevos puntos Objetos de la barra de herramientas. Desde el asistente de creación de objetos en el Área de propiedades, haga clic en la opción de omitir la creación automática, editar manualmente. Seleccione la lamina o canal marcador nuclear para mostrar los núcleos. Cambiar y haga clic en lefbotón del ratón t en todos los núcleos de un músculo específico en la imagen. Aparecerá un punto en cada núcleo. Seleccione los puntos a los puntos distancia más cercana que aparece en la pestaña Herramientas en el objeto Propiedades del área. Seleccione Estadísticas Spots bajo el modo de resultado y una ventana aparece Matlab. En la pestaña Estadísticas, seleccione valores detallados a continuación específicos. Haga clic en el Distmin y aparecerán los valores de las distancias mínimas para cada núcleo. Exportar los datos a un archivo de hoja de cálculo y calcular el promedio de estas distancias por músculo. Repita el procedimiento para todos los músculos de un cierto genotipo. 7. Determinación de la forma de los núcleos dentro de los músculos del cuerpo de pared de larvas de Drosophila Para este análisis, utilizar imágenes confocal de los músculos del cuerpo de paredes manchadas de lamina y un marcador nuclear para visualizar los núcleos. Para evaluar la forma de mionúcleos, medida esfericidad (definido como la relación entre el surárea de la cara de una esfera con el mismo volumen que el núcleo dado, a la superficie del núcleo) o elipticidad (distingue entre elipsoides alargados achatados / y esferoides). Abra la imagen como se describe anteriormente. Haga clic en el icono de la barra de herramientas Objetos Añadir nuevas superficies . En el asistente de creación que aparece en el objeto Área de propiedades, seleccione el marcador tinción nuclear como el Canal de la Fuente para mostrar los núcleos. Establecer la opción de intensidad absoluta como el umbral. Asegúrese de que la mayor parte de los núcleos muestran una representación suave y no sobrecargado cambiando el valor de la curva de umbral. Al mismo tiempo, evitar la presencia de agujeros o máscara incompleta a cualquier núcleo utilizando la misma curva. Utilizar el herramienta de filtro para excluir cualquier ruido en la prestación superficie. En la pestaña Editar de la capa superficial de nueva creación, división o fusión de los núcleos de las superficies que están incorrectamente rendered. Exportar a una hoja de cálculo presentar los valores de elipticidad y la esfericidad de la superficie mostrada núcleos que están disponibles en la pestaña Estadísticas. Alternativamente, utilizar el software ImageJ o Fiji para medir la circularidad de los núcleos donde la circularidad (C) se define como C . Un valor de uno representa un círculo perfecto, mientras que un valor cercano a cero indica una forma cada vez más alargada. Crear proyecciones de máxima intensidad de las pilas z de menú Imágenes> Pilas> Proyecto Z. Ajuste del tipo de proyección de máxima intensidad. Dividir los canales y seleccione el canal marcador nuclear. En el menú principal, seleccione Imagen> Ajuste> Umbral. Segmento de los núcleos mediante el ajuste de la intensidad umbral. Si los núcleos cercanos están segmentados como una sola unidad, haga clic en Proceso> Binary> herramienta de cuencas para desconectar los núcleos. En el menú principal, seleccione Editar> Selecciones> Crear selección. Añadir todas las regiones de interés seleccionadas en el Administrador de retorno de la inversión haciendo clic en el menú Análisis> Herramientas> Administrador de retorno de la inversión. En la ventana del Administrador de ROI haga clic en Agregar. Dentro de la misma ventana seleccione Más> Split. Seleccionar en descriptores de forma Analizar> mediciones indicadas. En la ventana del Administrador de retorno de la inversión clic en la pestaña Medida. Esto mostrará una lista de valores de circularidad de todos los núcleos seleccionados. Además, para medir el volumen nuclear, sigue asistente de creación de superficie usando el canal marcador tinción nuclear tal como se describe en las subsecciones 7.3-7.7. 8. Volumen Renders 3D de núcleos seleccionados dentro de los músculos del cuerpo de pared de larvas de Drosophila para evaluar la Intranucleares La localización de una proteína específica Use imágenes confocal de informes músculos de la pared corporal teñidas con un marcador nuclear y con anticuerpos específicos para lamina y DVAP. Abrir las imágenes al iniciar el software y select el núcleo específico a analizar. Esto se puede hacer seleccionando el principal elemento de menú Editar> Recortar 3D. Siga asistente de creación de superficie utilizando el canal de lamina tal como se describe en el apartado 7.3 a 7.7. Una vez creada la superficie, haga clic en Editar en la objetos Propiedades del área y luego seleccione Máscara todo para aislar la señal en el interior del núcleo. Esto crea una nueva ventana. Seleccione la señal de DVAP en el menú desplegable de selección de canal. Seleccione la señal de inmuno-reactividad DVAP el interior del núcleo haciendo clic en la opción set vóxeles fuera de la superficie a cero. Un nuevo canal enmascarado se crea y está disponible en la ventana de ajuste de visualización de la selección. Para visualizar la presencia de la señal dentro del núcleo crear un plano de contorno haciendo clic en el icono Agregar nuevo plano delimitador Objetos de la barra de herramientas. Interactiva ajustar el ángulo del recorteavión y su posición para visualizar la distribución de la señal en el interior del núcleo.