لماذا الكمي المسائل: توصيف الظواهر في<em> ذبابة الفاكهة</em> اليرقات عصبي عضلي مفرق
Summary
Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.
Abstract
معظم الدراسات على التشكل تعتمد على الوصف النوعية كيفية الصفات التشريحية تتأثر تعطيل جينات معينة ومسارات الوراثية. نادرا ما يتم تنفيذ الوصف الكمي، على الرغم من التلاعب الجيني تنتج مجموعة من الآثار المظهرية ولاحظت اختلافات حتى بين الأفراد داخل المجموعة الضابطة. شواهد يدل على التشكل وحجم وموقع من العضيات تلعب، دورا أساسيا بعد بالتقدير سابقا في وظائف الخلايا والبقاء على قيد الحياة. هنا نقدم إرشادات خطوة بخطوة لإجراء تحليلات كمية من الظواهر في ذبابة الفاكهة اليرقات الوصل العصبي العضلي (NMJ). نحن نستخدم العديد من علامات المناعية النسيجية موثوقة جنبا إلى جنب مع تقنيات التصوير الحيوي والمورفولوجية تحليل لدراسة آثار الطفرات الوراثية في العمليات الخلوية محددة. على وجه الخصوص، ونحن نركز على التحليل الكمي من الظواهر التي تؤثر على التشكل، حجم وموضع نuclei داخل العضلات المخططة من يرقات ذبابة الفاكهة. ذبابة الفاكهة اليرقات NMJ هو النموذج التجريبي قيما للتحقيق في الآليات الجزيئية الكامنة وراء بنية ووظيفة الجهاز العصبي العضلي، سواء في الصحة والمرض. ومع ذلك، فإن منهجيات وصفنا هنا يمكن أن تمتد إلى الأنظمة الأخرى كذلك.
Introduction
Qualitative analysis restricts the focus of most experimental studies to the examination of genetic manipulations leading to large phenotypic effects or to phenotypes that are not amenable to quantification, e.g., absence/presence. Quantification of phenotypes is not usually performed and variations present within members of a phenotypic group are not taken into consideration. Additionally, without mathematical descriptions of morphologies, it may be difficult to determine whether fine scale phenotypic changes are the result of genetically induced alterations or whether observed changes are simply due to random fluctuations.
We propose that for an accurate and unbiased analysis of phenotypic defects due to gene disruption, quantitative methodologies should accompany more traditional qualitative approaches. Quantitative evaluation of phenotypes is particularly beneficial for structures such as synapses that present a high degree of variability due to their intrinsic morphological and functional plasticity. We have selected examples of quantitative analyses applied to areas of investigation with which we are most familiar, namely the Drosophila larval neuromuscular junctions (NMJs). However, concepts and principles apply equally well to other experimental systems.
The larval NMJ is an excellent model system to study synaptic development and function because of the highly stereotyped nature of its structure. Each hemi-segment of the larval neuromuscular system contains 32 identifiable motor neurons forming synaptic contacts with their postsynaptic target muscle. Every hemi-segment also contains a fixed number of muscles visible as multinucleated fibers attached to the internal surface of the cuticle1. Another advantage of using the larval neuromuscular system is the power and versatility of Drosophila genetics that easily allows the generation of a number of mutant alleles and the possibility to modify gene expression in a time- and tissue-restricted manner. Finally, 75% of the human genes causing a disease have an evolutionarily conserved orthologue in Drosophila2. Indeed, entire genetic pathways are conserved between flies and humans. Because of this, the Drosophila larval neuromuscular system is a very popular experimental model to elucidate the molecular mechanisms underlying a number of human diseases including amyotrophic lateral sclerosis (ALS)1.
Here we show that the availability of several reliable immuno-histochemical markers, combined with bio-imaging techniques and accurate morphometric analyses can describe anatomical traits that are likely to play an important functional role3,4,5. Among the cellular processes that are amenable to quantitative analyses, we focus on changes in shape, size and position of intracellular structures such as the nuclei. All these are processes that we know very little about.
The challenge for molecular geneticists in the coming decades will be to extend our current knowledge by analyzing the effect of genetic mutations that produce very subtle phenotypic defects. Quantitative methodologies that allow researchers to meticulously explore the effects of genetic mutations can provide a more comprehensive understanding of how genotypes relate to phenotypes, especially for poorly understood cellular processes.
Protocol
Representative Results
Discussion
في الماضي، كان نادرا ما تؤخذ الاختلافات الشكلية داخل وبين المجموعات التجريبية في الاعتبار. ومع ذلك، فإن تطبيق الأساليب الكمية أصبحت الآن تحسب القاعدة في الدراسات المقارنة من التشكل ووصف رياضي من الأشكال التشريحية. استخدام الكمية والتحليلات في تقييم آثار التلاعب الجيني في العمليات الخلوية محددة، مبشرة في تعزيز قدرتنا على اكتشاف التغيرات المورفولوجية وفي تحسين الدقة التي تم وصفها هذه التغييرات. وعلاوة على ذلك، التحليل الإحصائي للبيانات الكمي يسمح لنا لتقييم ما إذا كانت الاختلافات الملاحظة بين الظواهر كبيرة.
في العضلات المخططة، نوى يحمل هيكل مدورة متميزة وتوزع بالتساوي على طول الألياف العضلية. على الرغم من أن الآليات الجزيئية إنشاء وصيانة حجم وشكل وبنية نواة ليست معروفة، هذه الميزات النووية المرجح رس تلعب دورا أساسيا في السيطرة على وظيفة العضلات. في الواقع، وسقوط عدد من الاعتلالات العضلية التي كتبها طفرات في الجينات التي تنظم التشكل وموقف نوى داخل العضلات. أهمية وظيفية من شكل وتوزيع نوى داخل الخلية لا يقتصر على العضلات. تراكم الأدلة تشير إلى أن ترتبط أيضا عيوب النووية مع الأمراض العصبية مثل مرض باركنسون 18،24. بالإضافة إلى ذلك، بدأنا ندرك أن التشكل، وحجم وتوزيع الخلايا من العضيات الأخرى بما في ذلك الشبكة الإندوبلازمية والميتوكوندريا قد يكون لها عواقب وظيفية. على سبيل المثال، ترتبط التغييرات في مورفولوجية الميتوكوندريا الذين يعانون من اضطرابات عصبية مثل نوع 1 البصرية ضمور (OPA1) وشاركو ماري توث نوع 2A الاعتلال العصبي 25.
للمساعدة في عملية توضيح الآليات الجزيئية الكامنة وراء هذه العمليات الهامة، فإننا نقترح الجمع بين عالية الدقة مبائرالبيانات مع برنامج التصوير والمورفولوجية ويحلل لتقييم كمي كيف التلاعب الجيني يمكن أن تؤثر على الشكل والحجم والموقع من نوى داخل الألياف العضلية. قوة وبراعة الوراثة ذبابة الفاكهة مع طبيعة نمطية للغاية من الجهاز العصبي العضلي في يرقات ذبابة الفاكهة تجعل اليرقات NMJ نموذج تجريبي مناسبة بشكل خاص لهذا النوع من التحليلات. وفي لل NMJs اليرقات، ويمكن إجراء التحليل المظهرية في قرار المشبك واحد مما يتيح تحليل المورفومترية دقيقة حيث يمكن دراسة عدد من لل NMJs داخل نفس الطاير ويمكن مقارنة حتى نفس التعرف NMJ بين الذباب من المورثات مختلفة 3،4.
التوصيف المظهري للموقف النووي والشكل والحجم في ذبابة الفاكهة اليرقات NMJ يبدأ عن طريق أداء المناعية لللل NMJs تشريح مع الأجسام المضادة التي تبرز العضلات ونوى داخل العضلات. في بروتوكول المبينة في ثيالصورة ورقة، كانت ملطخة myonuclei مع الأجسام المضادة ضد امين، علامة على المغلف النووي، مع علامة النووية تسليط الضوء على النووية الداخلية ومع الاجسام المضادة المحددة لDVAP وصمة عار على العضلات كلها. تفضلت الأجسام المضادة امين المستخدمة في هذه التجارب من قبل بول فيشر 19-22 لكن مصادر بديلة للأجسام المضادة للامين يمكن استخدامها. بالإضافة إلى ذلك، يتوفر تجاريا عددا من الأجسام المضادة أخرى محددة لالغلاف النووي. وأخيرا، علامات النووية، مثل دابي ويوديد propidium، وتتوفر أيضا في حين يمكن تصور العضلات عن طريق تلطيخ مع المضادة للالأكتين أو مكافحة تويولين الأجسام المضادة. وفي حالة تطبيق الأجسام المضادة غير تلك المستخدمة في هذا الإجراء التجريبي، فإن بروتوكول المناعية يتطلب-خطوات إضافية في أي ظروف تثبيت وتركيز العمل على الأجسام المضادة الجديدة سوف تحتاج إلى أن يكون الأمثل. خطوة حاسمة في هذا البروتوكول، وخصوصا عندما تحتاج إلى تحليل الاداءات حجم، هو الالبريد متزايدة من العينات على الشريحة. في هذه الحالة، فمن المهم أن تشمل الفواصل بين الشرائح وساترة بحيث العينات لا تحصل على سحق. ثلاث فرق من الشريط السليلوز ملفوفة حول الشريحة على كلا الجانبين من ساترة تمثل وسيلة سهلة لجعل الفواصل.
في حين تم استخدام يماغيج للصور 2D، أكثر من صورة متعددة القنوات 3D التحليلات الواردة في هذه الورقة تم القيام به، وذلك باستخدام Imaris لما له من توافر في المنزل. ومع ذلك، أي مماثلة حزمة برامج تجارية أخرى يمكن استخدامها لهذه التطبيقات.
هناك العديد من المصادر المفتوحة (على سبيل المثال، يماغيج، CellProfiler، Vaa3D، الجليدية، KNIME وغيرها) ومنصات البرمجيات التجارية المتاحة لتحليل الصور مبائر. يماغيج 26، البرمجيات الحرة من المعاهد الوطنية للصحة أو نسختها أكثر المحسن، والمعروفة باسم فيجي 27، لديها عدد كبير من المرشحات الاستيراد، وحدات الماكرو والإضافات المتاحة لالتصال التصوير في جميع أنحاء العالمتاي. وتتركز معظم هذه الإضافات على معالجة المعلومات على نحو شريحة شريحة حدة. وهناك أيضا الإضافات المتاحة لتصور وتحليل الصور 3D متعددة القنوات. ومع ذلك، في كثير من الأحيان أنها مصممة لمهمة محددة والمستخدمين قد تحتاج إلى توسيع أو التكيف مع هذه الإضافات لاحتياجاتها الخاصة. من ناحية أخرى، منصات تجارية تستهدف مستخدمين عديمي الخبرة نسبيا وغالبا ما تركز على سهولة الاستخدام، تغطية واسعة من المهام لمعالجة الصور مع سرعة لا تصدق.
إجراء التجارب إلى جانب تحليل المظهري الكمي الواردة في هذا البروتوكول، ويمكن أن تساعد في توضيح الآليات الجزيئية التي تتحكم في التشكل عضية وتوزيعها داخل الخلية. ومع ذلك، فإن هذا النهج لديه الحد الواضح من تحليل هذه العمليات في نهاية نقطة محددة. ومن المرجح أن تكون دينامية جدا وتختلف ليس فقط بين مختلف تاي خلية عملية السيطرة على التشكل وتوزيع العضياتعبوة ولكن أيضا داخل الخلية نفسها تبعا لحالة النمو أو الفسيولوجية. أن تكون ممثلة لمواصلة تنفيذ هذا التحليل من وقت التصوير مرور تسمح التغييرات في مورفولوجية عضية وموقف التي يتعين رصدها مع مرور الوقت.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to Dr. Andrea Chai for her insightful comments on the manuscript. This work was supported by the Wellcome Trust (grant number: Pennetta8920) and by the Motor Neuron Disease Association (grant number: Pennetta6231).
Materials
| Micro-Forceps 0.3×0.25 mm | Fine Science Tools | 11030-12 | |
| Sylgard dissection plates | SIGMA-ALDRICH | 76103 | Mix the pre-weighed elastomer base with curing agent. Poor the mixture into a 5 cm Petri dish. Let cure it at 60ºC for at least 24 hours |
| Stainless/Steel Minutien Pins 0.1 mm diameter | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Microdissection scissors (ultra-fine) | Fine Science Tools | 15200-00 | |
| 1x PBS (Phosphate Buffered Saline). Composition: 3mM NaH2PO4, 7mM Na2HPO4, 130mM NaCl, pH 7 | NaH2PO4 (SIGMA-S8282), Na2HPO4 (SIGMA-S7907), NaCl (SIGMA-S7653) | ||
| Bouin's Solution. Composition: Picric Acid, Formaldehyde, Acetic Acid (15:10:1) | Picric Acid (SIGMA 197378), Formaldehyde (F8775), Acetic Acid (SIGMA-1005706) | ||
| 1x PBT (Phosphate Buffered Saline with Triton). 1xPBS +0.1% Triton | Triton-X100. SIGMA-T8787 | ||
| Normal Goat Serum | SIGMA | G9023 | |
| Guinea Pig anti-DVAP antibody | Provided by Dr. Giuseppa Pennetta (University of Edinburgh, UK). Use at !:200 dilution in 5% NGS | ||
| Rabbit anti-HRP (Horseradish peroxidase) | Jackson ImmunoResearch | 123-065-021 | Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS |
| Rabbit anti-Lamin antibody | Provided by Dr. Paul Fisher (State Univeristy of New York at Stony Brook). Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS | ||
| TO-PRO-3 | Molecular Probes | T3605 | |
| Goat anti-rabbit antibody, Alexa Fluor488, conjugated | Jackson ImmunoResearch | bs-295G-A555-BSS | Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS |
| Goat anti-guinea pig IgG antibody, Cy3, conjugated | Jackson ImmunoResearch | bs-0358G-Cy3-BSS | Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS |
| Vectashield mounting medium for fluorescence | Vector laboratories | H-1000 |
References
- Collins, C. A., DiAntonio, A. Synaptic development: insights from Drosophila. Curr. Opin. Neurobiol. 17 (1), 35-42 (2007).
- Fortini, M. E., Skupski, M. P., Boguski, M. S., Hariharan, I. K. A survey of human disease gene counterparts in the Drosophila genome. J. Cell Biol. 150 (2), 23-30 (2000).
- Ramachandran, P., Budnik, V. Dissection of Drosophila larval body-wall muscles. Cold Spring Harb Protoc. (8), (2010).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. JoVE. (24), (2009).
- Brent, J., Werner, K., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ immunohistochemistry. JoVE. (25), (2009).
- Ramachandran, P., Budnik, V. Immunocytochemical staining of Drosophila larval body-wall muscles. Cold Spring Harb Protoc. (8), (2010).
- Ling, S. C., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Converging mechanisms in ALS and FTD: disrupted RNA and protein homeostasis. Neuron. 79 (3), 416-438 (2013).
- Nishimura, A. L., et al. A mutation in the vesicle-trafficking protein VAPB causes late-onset spinal muscular atrophy and amyotrophic lateral sclerosis. Am J Hum Genet. 75 (5), 822-831 (2004).
- Chen, H. J., et al. Characterization of the properties of a novel mutation in VAPB in familial amyotrophic lateral sclerosis. J Biol Chem. 285 (51), 40266-40281 (2010).
- Funke, A. D., et al. The P56S mutation in the VAPB gene is not due to a single founder: the first European case. Clin Genet. 77 (3), 302-303 (2010).
- Millecamps, S., et al. SOD1,ANG,VAPB,TARDBP, and FUS mutations in familial amyotrophic lateral sclerosis: genotype-phenotype correlations. J Med. Genet. 47 (8), 554-560 (2010).
- Landers, J. E., et al. New VAPB deletion variant and exclusion of VAPB mutations in familial ALS. Neurology. 70 (14), 1179-1185 (2008).
- Van Blitterswijk, M., et al. VAPB and C9orf72 mutations in 1 familial amyotrophic lateral sclerosis patient. Neurobiol Aging. 33 (12), 2951-2954 (2012).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Budnik, V., et al. Regulation of synapse structure and function by the Drosophila tumor suppressor gene dlg. Neuron. 17 (4), 627-640 (1996).
- Sanhueza, M., Zechini, L., Gillespie, T., Pennetta, G. Gain-of-function mutations in the ALS8 causative gene VAPB have detrimental effects on neurons and muscles. Biol Open. 3 (1), 59-71 (2014).
- Worman, H. J., Ostlund, C., Wang, Y. Diseases of the nuclear envelope. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (2), a000760 (2010).
- Liu, G. H., et al. Progressive degeneration of human neural stem cells caused by pathogenic LRRK2. Nature. 491 (7425), 603-607 (2012).
- Pennetta, G., Hiesinger, P. R., Fabian-Fine, R., Meinertzhagen, I. A., Bellen, H. J. Drosophila VAP-33A directs bouton formation at neuromuscular junctions in a dosage-dependent manner. Neuron. 35 (2), 291-306 (2002).
- Fisher, P. A., Berrios, M., Blobel, G. Isolation and characterization of a proteinaceous subnuclear fraction composed of nuclear matrix, peripheral lamina, and nuclear pore complexes from embryos of Drosophila melanogaster. J Cell Biol. 92 (3), 674-686 (1982).
- Smith, D. E., Fisher, P. A. Identification, developmental regulation, and response to heat shock of two antigenically related forms of a major nuclear envelope protein in Drosophila embryos: application of an improved method for affinity purification of antibodies using polypeptides immobilized on nitrocellulose blots. J Cell Biol. 99 (1), 20-28 (1984).
- Smith, D. E., Gruenbaum, Y., Berrios, M., Fisher, P. A. Biosynthesis and interconversion of Drosophila nuclear lamin isoforms during normal growth and in response to heat shock. J Cell Biol. 105 (2), 771-790 (1987).
- Puckelwartz, M. J., et al. Disruption of nesprin-1 produces an Emery Dreifuss muscular dystrophy-like phenotype in mice. Hum Mol Genet. 18 (4), 607-620 (2009).
- Tsujikawa, M., Omori, Y., Biyanwila, J., Malicki, J. Mechanism of positioning the cell nucleus in vertebrate photoreceptors. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (37), 14819-14824 (2007).
- Westermann, B. Mitochondrial fusion and fission in cell life and death. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (12), 872-884 (2010).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
