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Immunologie et infection

Saggi qualitativi e quantitativi per il rilevamento e la caratterizzazione di proteine ​​antimicrobici

Published: April 10, 2016
doi:
10.3791/53819
, ,
1Department of Advanced Technology,The MITRE Corporation, 2Center for Biomedical Engineering,Brown University, 3The MITRE Corporation

Summary

Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

Abstract

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.

Introduction

Antimicrobial agents play an essential role in targeting a wide range of microorganisms such as viruses, fungi, and bacteria. The antimicrobial activities produced by various bacteria range in target specificity from broad-spectrum to species-specific, including clinically relevant bacterial pathogens 1. In nature, protein antimicrobial compounds like bacteriocins and lysins represent a microbial arsenal of tools for self-defense, replication, and nutrient acquisition 2,3. Serving as mediators of population dynamics within microbial communities, protein antimicrobials provide a competitive advantage to the producing organism over nonproducing, sensitive species 4. As recombinant enzymes and probiotics, these proteins also have an economic and societal importance as the need for new sources of pathogen control increases with each new expansion of antimicrobial resistance within the bacterial population 5.

The first evaluations of newly discovered protein antimicrobials include determining the basic physical characteristics that are inherent to the enzyme. Methods for rapid screening of potential antimicrobials allow selection of candidates with hydrolytic activities against the desired target substrates. The microslide diffusion assay and the quantitative dye-release assay allow for the use of a variety of substrates in the detection of enzymatic hydrolysis. For protein antimicrobial enzymes with activity against the bacterial cell wall, the versatility of these assays allow rapid and effective, qualitative and quantitative screening against viable bacterial cells (microslide assay only), heat-killed whole bacterial cell substrates, or purified peptidoglycan from the target bacterium. These assays have utility in antimicrobial enzyme discovery for use in fields such as alternative therapeutics, food supplements, and inhibitors of biofilm production.

The microslide diffusion assay and the dye-release assay are demonstrated methods for detection and characterization of novel protein antimicrobials. The microslide diffusion assay provides a relative (qualitative) estimate of antimicrobial activity and allows for minimal inference of enzyme concentration and activity. Using this method, activity is readily visualized as the development of a zone of lysis with the absence of activity resulting in a lack of zone formation. The rate of zone development and the zone diameter are indicative of the amount and purity of the enzyme present in the sample; however, this rate and the quality of the substrate clearing within the zone can also be affected by the presence of contaminants, the completeness of the hydrolysis reaction, and the type of substrate. Interfering contaminants can affect the rate of enzyme diffusion from the well, while incomplete hydrolysis or variation of the substrate type can result in a turbid zone of lysis 6.

The dye-release assay quantitatively assesses the amount of covalently-linked Remazol brilliant blue R dye products released into the reaction supernatant from the enzymatically hydrolyzed substrate. The method has only slight variability associated with a difference in substrate, thus allowing greater sensitivity for detection of hydrolysis as compared to the microslide diffusion assay. These properties allow the method to have utility in the characterization of biochemical properties of the enzyme and in the standardization of the assay for comparison between different antimicrobial enzymes.

In this protocol, we provide methods to perform the basic microslide diffusion assay and dye-release assay, while demonstrating the scale of detection limits and variability for each. The assays are used to perform basic evaluations of an unknown protein antimicrobial purified from the culture supernatant of an uncharacterized soil bacterial isolate. Observed activities against bacterial cell substrates within the assays allow comparison of reaction activities between a previously uncharacterized protein antimicrobial and α-chymotrypsin, a control proteolytic enzymes. These protocols provide a foundation for the application of the two techniques that can be expanded and modified to accommodate varied applications.

Protocol

1. Preparazione di batteriche e peptidoglicano substrati Nota: substrati batteriche tutta la cella e peptidoglicani purificate sono utilizzati come substrati enzimatici sia il test di diffusione MicroSlide e il saggio di tintura-release. Questi substrati richiedono una preparazione prima di effettuare le reazioni enzimatiche. Il protocollo che segue descrive la loro preparazione. Tutto il substrato cellula batterica Produrre substrato cellula batterica inoculando 500 ml di brodo nutritivo con una cultura durante la notte 2 ml di Bacillus subtilis 168 (American Type Culture Collection; ATCC 23857). Incubare a 30 ° C con agitazione (125 rpm) fino alla coltura raggiunga una fase di crescita esponenziale, definita come una fase di crescita rapida conseguente raddoppio della coltura batterica. Per la coltivazione di Salmonella enterica subsp. Enterica (ATCC 10708), usare brodo nutriente come mezzo di crescita a 37 ° C con agitazione (125 rpm). </li> Calore-kill ciascuna coltura in autoclave per 10 minuti a 121 ° C sotto 3 atm di pressione. Raccogliere il substrato batterica ucciso al calore per centrifugazione per 20 minuti a 5000 x g. Lavare il pellet tre volte con acqua di tipo 1 e risospendere in una quantità minima di acqua. In questo studio, sospendere i substrati in 1.200 ml. Aliquota 300 ml di substrati cellulari batteriche provette da 1,5 ml microcentrifuga e conservare a 20 ° C. Purificata substrato peptidoglicano Purificare peptidoglicano dal substrato bersaglio batterio 7-10 o acquistare da un fornitore (vedi Materiali e attrezzature Tabella). Purificare preparati peptidoglicano grezzi da polimeri della parete cellulare accessori. 2. qualitativa MicroSlide Diffusion Assay [Modificato da Lachica, et al. 11] Nota: Il saggio MicroSlide diffusione èun metodo qualitativo per rilevare la presenza di enzima antimicrobico in un campione. Poiché l'enzima diffonde attraverso un substrato matrice contenente agarosio, una zona di compensazione sviluppa come l'enzima idrolizza il substrato. Il protocollo che segue descrive la preparazione e le prestazioni del test MicroSlide diffusione per rilevare qualitativamente la presenza di antimicrobici proteine. Determinare la concentrazione dell'enzima antimicrobica essere valutato utilizzando un kit di acido bicinconinico (BCA) Protein Assay secondo il protocollo del produttore. Utilizzare tampone fosfato salino (PBS) come un buffer enzimatica; tuttavia, determinare empiricamente la appropriata buffer per l'enzima data. Eseguire una diluizione seriale dell'enzima antimicrobica utilizzando tampone fosfato salino (PBS) come tampone di reazione. La diluizione in serie utilizzata in questi test di diffusione MicroSlide prodotto finale masse proteiche dosaggio di 0 pg, 10 pg, 100 pg, 1 ng, 10 ng, 100 ng, 1 mg e 10 mg per volume di reazione. Erogare masse proteine ​​in tubi microcentrifuga individuali e regolare i volumi di proteine ​​al 20 microlitri utilizzando PBS in preparazione per l'aggiunta di MicroSlide pozzetti di reazione. Fare una soluzione di agarosio 0,5% sciogliendo 0,25 g di agarosio in 50 ml di PBS. Riscaldare la soluzione a ebollizione fino l'agarosio è completamente sciolto. Determinare l'acqua persa durante il processo di fusione in peso e aggiungere di nuovo alla soluzione. Aggiungere 50 ml di sodio azide 10% in acqua alla soluzione di agarosio e regolare la temperatura della soluzione a 50 ° C in un bagno d'acqua. L'azide di sodio viene aggiunto per inibire la crescita batterica contaminanti durante l'incubazione del test MicroSlide diffusione. Se le cellule vitali sono utilizzati come substrato, omettere l'azide di sodio dalla soluzione di agarosio. Scongelare il substrato batterico ucciso al calore sul ghiaccio. Risospendere il substrato batterica in 12 ml della soluzione di agarosio a circa abbinare la torbidità di un McF 2.0Arland equivalenza standard (vedi Materiali Tavolo). Confronti le torbidità delle soluzioni visualizzando una linea nera su uno sfondo bianco attraverso le soluzioni, aggiungendo substrato batterico per l'agarosio fino a raggiungere la torbidità approssimativa. Pipettare Subito 3 ml della soluzione di agarosio-substrato a ogni MicroSlide (25 x 75 x 1 mm 3). Dopo diapositive solidificano, punch tre pozzi nello strato di agarosio-substrato di ogni MicroSlide utilizzando una sonda di carotaggio (4,8 mm di diametro). Aggiungere 20 ml di ogni diluizione in serie proteina regolata ai rispettivi pozzetti. Utilizzare PBS (20 ml) o albumina sierica bovina (5 mg in 20 ml PBS) in un controllo negativo. Utilizzare noti enzimi bacteriolytic appropriate per il substrato, come il lisozima, come controllo positivo. Incubare il vetrino in una camera umida a 37 ° C o la temperatura attività ottimale dell'enzima. La durata dell'incubazione dipende dalla concentrazione eattività specifica dell'enzima antimicrobica. Un tempo di reazione tipica è la notte (circa 16 ore). Dopo l'incubazione, osservare le diapositive sotto le immagini di luce e di acquisizione indiretta del saggio di sviluppo utilizzando una fotocamera digitale reflex con un obiettivo 60 mm alla distanza focale di circa 30 cm. Nota: L'attività enzimatica della proteina antimicrobica per il substrato proposta è correlata con lo sviluppo di un alone di idrolisi, che si forma attorno al nonché l'enzima diffonde nel agarosio. Per qualificare l'attività enzimatica, osservare le dimensioni delle zone che si formano intorno ad ogni bene. Alta attività enzimatica riferisce qualitativamente ad una zona più ampia, mentre la bassa attività enzimatica riferisce qualitativamente ad una zona più piccola. 3. substrato Labeling – Remazol Brilliant Blue R Dye Etichettatura [Modificato da Zhou 12] Nota: Nel saggio dye-release, il substrato è covalente linked per Remazol brillante colorante R blu. Il protocollo che segue descrive la preparazione di substrati enzimatici tinti. Fare una soluzione di 250 mm di idrossido di sodio (NaOH) sciogliendo 1 g di NaOH in 99 ml di acqua di tipo I da utilizzare per rendere la soluzione a 200 mm Remazol brillante R colorante blu (RBB). Fare una soluzione 200 mM RBB sciogliendo 1,25 g RBB in 98,75 ml ± 1 ml di una soluzione 250 mM NaOH fresco (passo 3.1). Risospendere le cellule batteriche calore ucciso ad una concentrazione di 0,5 g di peso umido in 30 ml di soluzione RBB. Per peptidoglicano purificato, risospendere il peptidoglicano ad una concentrazione di 0,3 g di peso umido in 30 ml di soluzione di RBB. Incubare la miscela di reazione in una beuta su una piattaforma rotante per 6 ore a 37 ° C con miscelazione delicata. Trasferire la miscela di reazione in un incubatore a 4 °, e incubare per altri 12 hr con miscelazione delicata. Dopo l'incubazione, raccogliere il substrato tinto per centrifugazione a 3.000 xgper 30 min. Decantare la soluzione colorante dal pellet substrato. Rimuovere colorante solubile non covalente legato dai substrati lavando le cellule colorante marcato o peptidoglycan ripetutamente (circa 3-5 lavaggi) con acqua di tipo I seguita da centrifugazione. Con ogni aggiunta di acqua, risospendere accuratamente il pellet. Nota: Quando non legato tintura, solubile non è più visibile nel lavaggio con acqua dopo la centrifugazione. Il substrato dovrebbe essere dato un lavaggio supplementare. Si noti che il substrato rimarrà blu, mentre il surnatante della ultimo lavaggio sarà chiaro. Memorizzare i substrati tinti sospese in una quantità minima di acqua a -20 ° C per un uso successivo. 4. Quantitative Dye-release Assay Nota: Durante il test di colorante-release, l'idrolisi del substrato RBB-tinto nelle versioni di reazione enzimatiche prodotti tinti nel surnatante reazione. misura colorimetrica della quantità di colorante rilasciato indica l'amount dell'attività enzimatica presente nel campione per un dato enzima. Il metodo quantitativo permette il confronto delle differenti enzimi attraverso substrati e permette la variazione delle condizioni ambientali influenzano la reazione enzimatica (ad esempio, temperatura, salinità e pH). Il protocollo che segue descrive la preparazione e le prestazioni del dosaggio dye-release per rilevare quantitativamente l'attività enzimatica della proteina antimicrobici. Preparazione per il saggio Dye-release Lasciare il substrato tinto congelati per tornare a temperatura ambiente e lavata due volte con tampone (PBS), che è empiricamente determinata per l'enzima data. Calcolare il volume di sospensione substrato che è necessario moltiplicando il volume di reazione 200 microlitri per il numero di saggi dye a rilascio da eseguire. Preparare la sospensione substrato aggiungendo substrato tinto al volume di tampone, determinata 4.1.2, fino ad una densità ottica (OD) di 2,0 si ottiene a 595 nm utilizzando uno spettrofotometro. Per rimanere entro i limiti funzionali dello spettrofotometro, misurare il 2,0 OD 595 come 1.0 a 1: 1 diluizione della soluzione concentrata. Utilizzare tampone come bianco. Nota: La torbidità substrato per la reazione può essere sollevato oltre 2.0 per abbinare i livelli di attività di enzimi altamente efficienti. Sospendere il antimicrobico proteine ​​da valutare in tampone ad una concentrazione stimata di 1 mg / ml. Utilizzando il test micropiastra di un kit di analisi BCA Protein secondo il protocollo del produttore, determinare la concentrazione effettiva del campione di proteine ​​deve essere analizzato. Regolare la concentrazione della sospensione di 1 mg / ml utilizzando tampone. Usando il saggio Dye-release per determinare l'incubazione condizioni ottimali per una proteina antimicrobica Diluire il brodo di proteine ​​sospensione antimicrobico a 100 ng / ml. Questa concentrazione dà afmassa di reazione inale di 1 mg di proteina per volume (10 microlitri) aggiunto alla reazione dosaggio. Determinare il campo termico da valutare per la proteina bacteriolytic. La gamma termica in questi saggi inclusa 5 ° C, 15 ° C, 25 ° C, 35 ° C, 45 ° C, 55 ° C e 65 ° C. Eseguire i test di reazione in 0,5 ml tubi microcentrifuga. Per ogni condizione termica, aggiungere 10 ml di proteine ​​stock da 200 ml di sospensione substrato preparato. Incubare in un termociclatore per 8 ore con miscelazione per inversione una volta ogni ora. Dopo l'incubazione, arrestare le reazioni aggiungendo 25 ml di etanolo. Rimuovere digerito, substrato insolubile per centrifugazione a 3.000 xg per 2 minuti, e trasferire 150 ml di surnatante di reazione per ciascuna miscela di reazione ad una micropiastra a 96 pozzetti a fondo piatto, facendo attenzione a non disturbare il pellet di substrato non digerito. Misurare l'attività enzimatica della proteina AntimicrobIAL per il substrato proposta determinando la quantità di colorante solubile RBB dissociato dal substrato dopo idrolisi enzimatica. Per quantificare l'attività enzimatica, misurare l'assorbanza del surnatante a 595 nm utilizzando uno spettrofotometro per micropiastre. Aumento assorbanza dal colorante solubile rilasciata nel surnatante dal substrato marcato è una misura quantitativa dell'attività enzimatica. Nota: Le variazioni di assorbanza è rappresentato da unità di attività (AU), dove 1 AU determina un aumento del 0,01 della densità ottica del surnatante reazione colorante release a 595 nm. Una reazione vuoto, incubate con tutti i componenti della reazione ad eccezione di enzima, viene utilizzato per sottrarre il colorante che libera dal substrato RBB-classificazione in base al incubazione. La temperatura ottimale enzimatica fornisce la misura unità picco di attività. Ripetere i passaggi 4.2.1 tramite 4.2.7 utilizzando vari buffer di incubazione, per determinare le condizioni di buffer ottimali per l'enzima antimicrobica. in tsaggi hese, usano PBS. Usando il saggio Dye-release per determinare la concentrazione minima attivo alla temperatura ottimale di incubazione per una proteina antimicrobica Eseguire una diluizione seriale del magazzino sospensione proteina antimicrobica tramite tampone. La gamma serie di diluizioni varierà con l'attività dell'enzima antimicrobica. La diluizione d'ordine utilizzati per questi test ha prodotto finale quantità di proteine ​​dosaggio di 0 pg, 10 pg, 100 pg, 1 ng, 10 ng, 100 ng, 1 mg e 10 mg. Eseguire ogni saggio di reazione in una micropiastra fondo 48-ben piatta. Per ciascuna condizione dosaggio, aggiungere 10 ml di sospensione rispettiva proteina per 200 ml di sospensione substrato preparato. Regolare qualsiasi variazione di volume della soluzione proteica aggiunto alla reazione di 10 microlitri utilizzando tampone di reazione. Sigillare la micropiastra con la pellicola piastra saldante per evitare variazioni di volume a causa dell'evaporazione. Incubare in un incubatore shaker a ottimale determinatotemperatura cubation per la data proteina antimicrobica per 16 ore con agitazione. Dopo l'incubazione, arrestare la reazione aggiungendo 25 ml di etanolo a ciascun pozzetto e rimuovere substrato digerito mediante centrifugazione a 3000 xg per 2 min. Trasferire 150 ml di surnatante di reazione per ciascuna miscela di reazione ad una micropiastra a 96 pozzetti a fondo piatto, facendo attenzione a non disturbare il pellet del substrato non digerito. Per quantificare l'attività enzimatica, misurare l'assorbanza del surnatante a 595 nm utilizzando uno spettrofotometro per micropiastre. Una reazione vuoto, incubate con tutti i componenti della reazione ad eccezione di enzima, viene utilizzato per sottrarre il colorante che libera dal substrato RBB-classificazione in base al incubazione. Aumento assorbanza dal colorante solubile rilasciata nel surnatante dal substrato marcato fornisce una misura quantitativa di attività enzimatica. Nota: La variazione di assorbanza è rappresentato da unità di attività (AU), dove 1 AU risultati in0,01 aumento della densità ottica del surnatante reazione colorante release a 595 nm.

Representative Results

Il saggio MicroSlide diffusione e la tintura test-rilascio quantitativa sono metodi efficaci per lo screening e misurare le indagini iniziali di nuovi antimicrobici proteine. Ogni test ha vantaggi e limitazioni; Tuttavia, quando eseguito in combinazione, consentono un rapido screening iniziale e caratterizzazione di base di un antimicrobico. Il test di diffusione MicroSlide permette in modo efficiente per lo screening rapido di librerie microbiche, la produzione di proteine ​​antimicrobici. Quando i livelli di concentrazione enzimatica sono di preoccupazione, sensibilità di rilevamento vincoli possono limitare il dosaggio, che richiede una maggiore quantità di enzima da aggiungere alla reazione ben più saggio dye-release. Come illustrato in figura 1, le proprietà qualitative del saggio permettono all'osservatore di confrontare importi enzimatici relativi presenti in ogni pozzetto. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = "1"> Nella zona di sviluppo di lisi, illustrata nella Figura 1A (25 mg di enzima), il bordo anteriore della zona visualizza lisi torbida o incompleta del substrato, mentre la zona più vicina al pozzo visualizza una lisi substrato più completa. Questo fenomeno, un prodotto della concentrazione diminuzione dell'enzima diffusione all'avanguardia, complica la misurazione accurata del diametro della zona. Come i pozzetti vengono osservati in Figura 1 B (15 mg), C (10 mg), D (5 mg), E (1,0 mg), e F (0,1 mg), il diametro della zona di completo lisi dissipa all'estinzione correlando alla ridotta quantità di enzima. Per la condizione F (0,1 mg), la concentrazione dell'enzima all'interno agarosio è inferiore al limite che permetterà l'enzima diffondente da visualizzare come si muove attraverso l'agarosio, idrolisi del substrato. Il saggio MicroSlide diffusione è stato eseguito utilizzando anche purificati Bacillus subtilis Peptidoglycan come substrato (Figura 2). Mentre la zona è meno definito rispetto a quelli osservati con cellule intere Salmonella enterica causa della riluttanza dei peptidoglicano sospendere uniformemente in agarosio, l'idrolisi del peptidoglicano dall'enzima antimicrobica ignoto è evidente. Il saggio dye release è un test più sensibile e versatile del dosaggio MicroSlide diffusione, consentendo un limite di sensibilità e variazione di fattori ambientali influenzano la reazione enzimatica. Nei saggi rappresentativi, la temperatura è stata variata per determinare la temperatura ottimale per l'enzima antimicrobica, determinata essere 35 ° C in PBS (Figura 3). Questo ottimale si vede chiaramente nelle surnatanti di reazione come una maggiore quantità di colore blu (Figura 3B), così come rappresentato in unità di attività conseguenti a misurazioni di assorbanza a 595 nm (Figura 3A). Ilversatilità del dosaggio dye-release consente al ricercatore di variare non solo le temperature ma anche il tampone di reazione e componenti tampone per determinare rapidamente condizioni di incubazione ottimali per un dato enzima. Il livello di attività dell'enzima sconosciuta antimicrobica (Figura 4) e l'enzima comando α-chimotripsina (Figura 5) sono stati misurati alla temperatura di incubazione ottimale determinato di 35 ° C in PBS contro substrato ucciso al calore Bacillus subtilis RBB-marcato. Il confronto dei risultati di figura 4 e figura 5 indica che l'enzima antimicrobica sconosciuta ha quasi due volte l'affinità per l'B. subtilis substrato. Inoltre, il controllo α-chimotripsina non digerire completamente i ucciso al calore B. subtilis substrato all'interno del pozzo (dati non mostrati). L'attività del controllo di α-chimotripsina comincia a piastraau circa 0,3 mg rispetto al continuo aumento in unità di attività di tutti gli importi enzimi per l'enzima antimicrobica sconosciuta (figura 4 e figura 5). Questo potrebbe indicare che l'enzima sconosciuto ha una maggiore attività sostenuta o che ci sono un numero maggiore di siti di taglio disponibili all'enzima all'interno B. subtilis substrato. Figura 1:. Enzyme attività contro Salmonella enterica cellula intera substrato Il saggio MicroSlide diffusione è stato utilizzato per valutare qualitativamente l'attività di una proteina antimicrobica sconosciuto contro il calore ucciso Salmonella enterica subsp enterica (ATCC 10708).. Le masse proteici del antimicrobica sconosciuta sospesa in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) che sono stati aggiunti ai rispettivi pozzettigli scivoli inclusi 25 mcg (beh A), 15 mg (bene B), 10 mcg (bene C), 5 mg (beh D), 1 mg (beh E), e 0,1 mg (ben F). solo PBS è stato utilizzato per i controlli negativi dei saggi. Zone di lisi sono stati ripresi dopo una incubazione 6 ore. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 2:. Enzyme attività contro Bacillus subtilis cellulare peptidoglicano parete Il saggio MicroSlide diffusione è stato utilizzato per valutare qualitativamente l'attività di una proteina antimicrobica sconosciuto contro peptidoglycan di Bacillus subtilis 168. Sospeso in 20 ml di PBS, 10 ug del antimicrobica sconosciuta è stato aggiunto al pozzetto A delle microslides. solo PBS è stato usato come negativocontrollo per il saggio (bene B). La zona di lisi è stato ripreso dopo una incubazione di 6 ore a 37 ° C. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 3:. Ottimale Reazione temperatura per una proteina antimicrobica La versatilità del dosaggio dye-release consente la variazione di parametri fisici e chimici, quali temperature di incubazione e tamponi, per determinare le loro influenze sull'attività dell'enzima di interesse 6. Come illustrato in questa figura, l'attività della proteina antimicrobica sconosciuta (1 mg) è stata valutata in PBS contro RBB-etichettati Bacillus subtilis calore ucciso sotto una gamma di temperature di incubazione. Visualizzato come unità di attività (AU) in (A), l'assorbanza di RBB-bound prodotti rilasciati nel surnatante dopo idrolisi è stata misurata a 595 nm utilizzando uno spettrofotometro per micropiastre. Ad ogni condizione di temperatura, reazioni senza enzima aggiunto stati usati per sottrarre gli effetti di qualsiasi colorante rilasciato che il risultato di incubazione a varie temperature. I surnatanti di reazione corrispondenti ad ogni temperatura di incubazione sono stati ripresi prima della misura di assorbanza (B). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 4:. Intervallo attività per una proteina antimicrobica La gamma di attività per il antimicrobica proteina sconosciuta è stata misurata come unità di attività dopo incubazione overnight per 0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 e 1.000 ng , come misurato dal prot BCAassay ein (A). Per queste reazioni, il RBB marcato B. livello del substrato subtilis è stato portato a dare una densità ottica di 5,0 a 595 nm per garantire che la reazione con la più alta quantità di enzima (1.000 ng) non idrolizza completamente tutta substrato disponibile entro il periodo di incubazione di reazione. Le reazioni di controllo senza enzima aggiunto stati usati per sottrarre gli effetti di qualsiasi colorante rilasciato causata dalla sola incubazione. I surnatanti di reazione corrispondenti ad ogni quantità dell'enzima sono stati ripresi prima misure di assorbanza (B). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 5:. Gamma di attività per la α-chimotripsina La gamma di attività per la α-chimotripsina è stata misurata come activunità lità dopo incubazione overnight per 0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 e 1.000 ng di enzima (A). Per queste reazioni, il RBB marcato B. livello del substrato subtilis è stato portato a dare una densità ottica di 5,0 a 595 nm per garantire che la reazione con la più alta quantità di enzima (1.000 ng) non idrolizza completamente tutta substrato disponibile entro il periodo di incubazione di reazione. Le reazioni di controllo senza enzima aggiunto stati usati per sottrarre gli effetti di qualsiasi colorante rilasciato causata dalla sola incubazione. I surnatanti di reazione corrispondenti ad ogni quantità dell'enzima sono stati ripresi prima misure di assorbanza (B). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

Il saggio MicroSlide diffusione e il test di tintura-stampa forniscano vantaggi per la rilevazione e la caratterizzazione di proteine ​​antimicrobici precedentemente non identificati. Questi metodi rapidi e sensibili permettono di high-throughput screening di librerie di origine organismo per l'identificazione di enzimi di interesse prima di investire maggiori risorse per la ricerca. Come alto profilo enzimi bersaglio sono identificati, variazioni dei test di rilevazione possono essere utilizzati per rilevare rapidamente l'enzima o per determinare caratteristiche biochimiche dell'enzima. Ad esempio, durante una schema di purificazione proteica multistep, il saggio MicroSlide diffusione può rapidamente rilevare frazioni contenenti l'enzima di interesse. Inoltre, optima reazione per l'enzima può essere determinato alterando i buffer di reazione e temperature di incubazione nel test dye-release.

La gamma della massa enzima necessario per la rivelazione nel saggio MicroSlide diffusione è una funzione di caratterizzazione enzimaticistiche. limiti di rilevazione del test richiedono generalmente l'impiego di una maggiore quantità di enzima rispetto saggio dye-release. In questo studio, confronto dei limiti di segnalazione dell'analisi MicroSlide diffusione (Figura 1) per il saggio dye-release (figura 4) illustra che il saggio MicroSlide diffusione è una tecnica meno sensibile saggio dye-release. Quando la concentrazione dell'enzima non è un problema, il saggio MicroSlide permette un rapido screening iniziale di librerie per la produzione di proteine ​​antimicrobici contro substrati bersaglio con bassi di manodopera e attrezzature richieste. Anche se richiede uno sforzo maggiore e le attrezzature, il saggio di tintura-release è più sensibile e riproducibile, ottenendo risultati quantitativi che consentono il confronto tra i test di colorante a rilascio dello stesso o di diversi enzimi per un determinato substrato. I due metodi sono eseguiti facilmente nella maggior parte dei laboratori microbiologici senza necessità di strumentazione altamente specializzato. Nel representasaggi tive, l'enzima di controllo, α-chimotripsina, è stata rilevata a valori bassi quanto 100 ng (Figura 5) usando il saggio dye-release, mentre la quantità minima rilevata nel saggio MicroSlide diffusione era 1 ug (dati non mostrati).

Fornire utilità come test determinazione qualitativa per gli enzimi antimicrobici, un certo numero di variazioni del dosaggio diffusione sono stati segnalati 11,13. Rivedendo questi test, il test MicroSlide diffusione è stato sviluppato per la sua relativamente alta sensibilità come una schermata iniziale e per la sua facilità di osservanza reazione. Modificato dal lavoro di Lachica et al. 11, in cui le sovrapposizioni agarosio sono stati usati per rilevare la produzione di nucleasi da ceppi di Staphylococcus aureus, il saggio diffusione MicroSlide funziona in modo simile al metodo radiale immunodiffusione 14 come la proteina diffonde dal pozzo nel agarosio contenente il substrato. Il immunodiffu radialeMetodo sione arresta l'espansione della zona di immunoprecipitazione quando il sistema raggiunge un equilibrio formazione complesso tra l'antigene e l'anticorpo diffusione all'interno agarosio. Al contrario, il substrato del saggio MicroSlide diffusione è inizialmente digerito dal antimicrobica proteine ​​diffondente in una zona in continua espansione di lisi circonda il pozzo. La crescente diametro della zona continua finché l'enzima perde attività o il substrato è esaurito. La velocità di produzione della zona di lisi è accelerato come purezza, e quindi l'attività specifica, dell'enzima oppure la concentrazione dell'enzima aggiunto al pozzetto aumenta.

Per valutare quantitativamente l'attività enzimatica di antimicrobici proteina contro il calore ucciso B. subtilis, il saggio di tintura-release è stato scelto. test colorimetrici che utilizzano Remazol brillante colorante blu R (RBB) -labeled substrati permettono di valutazione versatile e sensibile di proteine ​​Activi antimicrobicoty. idrolisi enzimatica dei risultati substrato RBB marcate nel rilascio di prodotti solubili blu che può essere facilmente misurata con uno spettrofotometro a 595 nm. Diverse varianti di dosaggio colorante rilascio RBB, sviluppati per caratterizzare altre proteine ​​enzimi antimicrobici, mostrano la flessibilità di questo saggio per applicazione con altri substrati. Ad esempio, nel determinare gli effetti di lysostaphin attività bacteriolytic, Zhou, et al., Ha registrato un saggio di tintura a rilascio utilizzando cellule di stafilococco RBB-tinti e stafilococchi peptidoglicano come substrati 12. In una modifica dell'applicazione di questo test dye release RBB, RBB marcato substrato luteus Micrococcus stato proposto per l'uso come un mezzo rapido e sensibile per diagnosticare e schermo per malattie come infezioni batteriche e la presenza di un carcinoma maligno, che può essere correlato a livelli di espressione lisozima umani nel siero del sangue 15. Inoltre, substrati cellulari batteriche RBB-etichettati hannoLSO stato utilizzato in un metodo zimogramma per la rilevazione di lisozima 16.

Dimostriamo il limite abbassato di rilevazione, la convenienza, e la riproducibilità del test dye-release, che consente per lo screening della libreria rapida per la produzione di enzimi. Modifiche del dosaggio consentono test di caratterizzazione valle quantitative biochimiche, inclusi gli effetti di temperatura, pH, salinità e nonché gli effetti di altri enzimi proteolitici sull'attività delle proteine ​​antimicrobiche 6. Inoltre, il saggio dye-release quantitativa può essere utilizzata per confrontare le attività di più enzimi per un determinato substrato. Il saggio dye release RBB ha segnalato utility per enzimi con attività contro polisaccaridi in aggiunta alla caratterizzazione e la rilevazione di proteine ​​agenti antimicrobici. Pettersson e Eriksson riportato un test per la rilevazione di attività endoglycanase utilizzando amorfi, perline polisaccaridi RBB-tinti di cellulosa, xilano, mannano, e chitin 17. In un'espansione di questi risultati, un metodo sensibile per la rilevazione degli enzimi chitinasi prodotta da Bacillus thuringiensis Bt-107 è stato sviluppato utilizzando chitina colloidale marcato con RBB 18. Da questi e altri studi, le fonti disponibili in commercio di substrati RBB-tinti sono emerse per l'utilizzo nella rilevazione di attività glicolitica, compresi quelli contro la cheratina, amilopectina, amilosio, il glicogeno, laminarin, D-silano, glucano Azo-orzo, e amido.

In questo studio, dimostriamo l'utilità del saggio dye-release in un formato micropiastra, riducendo il volume di substrato RBB-marcato e enzima necessario per produrre il risultato colorimetrico. Come illustrato in figura 4 e figura 5, il saggio dye-release micropiastre fornisce un limite di rilevazione inferiore al dosaggio diffusione MicroSlide per rivelazione di attività enzimatica. Per quanto riguarda il rapido utilizzo, la conservazione del lavoro, e la facilità di interpretazione, il microfonoassay diffusione roslide fornisce utilità schermi high-throughput iniziali per la presenza di attività antimicrobica e l'indicazione della presenza della proteina antimicrobica in passi di isolamento e purificazione di proteine ​​a valle. La combinazione di questi due saggi completano in screening iniziale e finale caratterizzazione di nuovi antimicrobici proteine

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was funded by The MITRE Corporation through the MITRE Innovation Program (Project 25MSR621-CA). The authors would like to thank Mark Maybury, Ph.D., Richard Games, Ph.D., James Patton, Ellen Mac Garrigle, Ph.D., Carl Picconatto, Ph.D., and Caroline Gary for their support and review of this work.

Materials

48-well flat-bottom microplate with low evaporation lid Becton Dickinson 3078
96-well flat-bottom microplate (Costar 3595) Corning, Inc. 3595
agarose Fisher Scientific BP162-100
α-chymotrypsin MP Biomedicals 215227205
Bacillus subtilis 168 American Type Culture Collection 23857
C1000 Touch Thermal Cycler Bio-Rad
cork borer Humboldt H-9661
lysozyme Sigma-Aldrich L6876-1G
McFarland equivalence standard (2.0) Fisher Scientific R20412
microslides Fisher Scientific 22-38-103
nutrient broth Fisher Scientific S25959B
peptidoglycan of Bacillus subtilis 168 Sigma-Aldrich 69554-10MG-F
phosphate-buffered saline (1×) Teknova P0200
Pierce BCA Protein Assay Kit Life Technologies 23227
Synergy HT microplate spectrophotometer BioTek Instruments, Inc.
Remazol brilliant blue R dye (RBB) Sigma-Aldrich R8001
Salmonella enterica subsp. enterica American Type Culture Collection 10708
sodium azide Fisher Scientific S227-100
sodium hydroxide (NaOH) Fisher Scientific S318-500
Titer Tops pre-cut adhesive polyethylene film Diversified Biotechnology T-TOPS-50
UltraPure distilled water Invitrogen 10977-015
Name Company Catalog Number Comments
Solution
agarose solution
50 ml PBS
0.25 g agarose		 Add 10% sodium azide to the molten PBS/agarose solution
nutrient broth medium
4 g nutrient broth
500 ml Type I water
250mM sodium hydroxide (NaOH) solution
1 g NaOH
99 ml Type I water
200mM Remazol brilliant blue R dye (RBB)
1.25 g RBB
98.75 ml 250 mM NaOH solution
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References

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Citer Cet Article
Farris, M. H., Ford, K. A., Doyle, R. C. Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials. J. Vis. Exp. (110), e53819, doi:10.3791/53819 (2016).
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