שיטה פשוטה עבור צפיפות Ultra-Low, לטווח ארוך ראשית בהיפוקמפוס Neuron תרבות
Summary
Low density cultures of primary hippocampal neurons usually require glia feeder layer to supply neurotrophic factors and sustain longevity. We describe here a simplified method to culture ultra-low density neurons on glass coverslips in the presence of a high density neuronal feeder layer, which facilitates investigation of specific neuronal-autonomous mechanisms.
Abstract
Culturing נוירונים בהיפוקמפוס העיקריים במבחנת מקלת חקירת מכניסטית של היבטים רבים של התפתחות עצבית. נוירונים בהיפוקמפוס עובריים ניתקו לעתים קרובות יכולים לגדול בהצלחה על זכוכית coverslips בצפיפות גבוהה בתנאי סרום ללא, אבל תרבויות בצפיפות נמוכות בדרך כלל דורשות אספקה של גורמי trophic ידי שיתוף culturing אותם בשכבה מזינה גליה, הכנה אשר יכול להיות זמן רב ומייגעת. בנוסף, הנוכחות של גליה עלולה לבלבל פרשנות של תוצאות ומחקרים ימנעו על מנגנוני נוירון ספציפי. כאן, שיטה פשוטה מוצגת צפיפות נמוכה במיוחד (~ 2,000 נוירונים / 2 סנטימטר), לטווח ארוך (> 3 חודשים) תרבות נוירון בהיפוקמפוס העיקרית היא בתנאים חופשיים בסרום וללא תמיכת תא גליה. נוירונים בצפיפות נמוכים גדלים על coverslips מצופה פולי- D- ליזין, ומתהפכים על נוירונים בצפיפות גבוהים גדלו צלחת 24 גם. במקום להשתמש נקודות פרפין ליצור מרחב between את שתי שכבות עצביות, הנסיינים פשוט יכולים לחרוט בתחתית הפלסטיק של הבאר, שעליו הנוירונים בצפיפות הגבוהים מתגוררים, כדי ליצור microspace תורמת לצמיחת נוירון בצפיפות נמוכה. שיתוף התרבות יכולה להישמר בקלות> 3 חודשים ללא הפסד משמעותי של נוירונים בצפיפות נמוכים, ובכך להקל על הבדיקה מורפולוגית ופיזיולוגית של הנוירונים האלה. כדי להמחיש מצב התרבות המוצלח הזה, נתונים ניתנים להראות היווצרות הסינפסה פזרנית בתאים בצפיפות נמוכים לאחר תרבות ממושכת. מערכת שיתוף תרבות זה מאפשרת גם את ההישרדות של נוירונים בודדים דלילים הגדלים איים של מצעי פולי- D- ליזין וכך היצירה של קשרי autaptic.
Introduction
גידול נוירונים בהיפוקמפוס בתנאים חוץ גופית מאפשר תצפית מניפולציה ניסויית של הנוירונים האלה כי הם אחרת לא ניתן in vivo. גישה ניסויית זו נמצאת בשימוש נרחב כדי לחשוף את המנגנונים עצביים של צמיחה, קוטביות, מפרט neurite, סחר ולוקליזציה subcellular של חלבונים, היווצרות הסינפסה והתבגרות פונקציונלית 1. במבחנה אלו נוירונים בהיפוקמפוס תרבותיים, כאשר קוצרים בשלבים עובריים מאוחר, יחסית טהורים (> 90%) תאי glutamatergic של מורפולוגיה פירמידת 2. בגלל נוירונים גדלו משטח 2-D בתנאים במבחנה, שיטה זו מאפשרת התבוננות קלה, כגון הדמיה לחיות או immunocytochemistry (ICC) מכתים באמצעות מטוס בודד מוקדי 3; או מניפולציות, כגון טיפול תרופתי ו transfections 3-6. כאשר גדל בצפיפות גבוהה, נוירונים נוטים להיות בעלי שיעור גבוה של הישרדות בגלל שיתוף גבוהncentrations של גורמי גדילה מופרשים בנוסף לתמיכת עיכול מתקשורת הצמיחה, וגם בגלל מנגנוני קשר תלוי neurite 7. עם זאת, נוירונים בהיפוקמפוס נמוך צפיפות רצויים ללימודי מורפולוגיים, שבו נוירון יחיד ניתן הדמיה בשלמותו או מוכתם לניתוח ICC. נוירונים בצפיפות נמוכה קשה לשמור בתרבות בשל חוסר תמיכה paracrine וכך לעיתים קרובות דורשים תמיכה trophic מתוך גליה שכבת מזין (בדרך כלל קליפת המוח astrocyte), אשר צריך להיות מוכן לפני נוירון תרבות 2. כאשר שיתוף תרבותי עם שכבת מזין תאים גליה, הנוירונים בצפיפות נמוכה גדלים על coverslips, ולאחר מכן התהפך על גבי שכבת גליה כך הנוירונים בצפיפות נמוכה גליה הם פונים זה לזה. מקום מוקף קטן בין גליה נוירונים נוצר על ידי הצבת נקודות פראפין על הפינות של coverslips, ולכן יצירת פריסה 'סנדוויץ' 2,8,9. הנוירונים בצפיפות הנמוכים יגדלו within המוקף בין גליה ואת coverslip, אשר יוצר microenvironment מתירנית עם גורמים מרוכזים מופרשים על ידי תאי עצב גליה. גישה זו מניבה בצפיפות נמוכה, נוירונים מפותחים כי הם במרווחים סבירים, ולכן תיוג ICC להקל או בדיקות הדמיה לחיות.
חסרון לכאורה של תרבות שיתוף נוירון, גליה, מלבד היותם זמן רב ומייגע, הוא בכך שהיא מונעת מחקר של נוירון הספציפי, או תאים אוטונומיים, מנגנונים. למרות מערכת זו היא הרבה פחות מורכבת מאשר vivo רקמה עצבית, השפעה גליה על פיתוח נוירון דרך מופרש, גורמים לא-עדיין-מוגדר באופן מלא יכול לבלבל הניסויים 10. לכן, בניסויים הדורשים חקירת מנגנוני נוירון ספציפיים, תנאי תרבות מוגדרות המסירים בסרום שכבת תמיכת גליה נחוצים. מחקר קודם הצליחה culturing ריכוזים נמוכים של נוירונים (~ 9,000 תאים / 2 ס"מ) באמצעות המטריקס הידרוג'ל ממדי רי 11. מאז אוכלוסייה עצבית יחסית טהורה יכולה להיות מתורבתת בצפיפות גבוהה בתנאים חופשיים בסרום ללא תמיכת גליה, אנו משערים כי צפיפות נמוכה במיוחד של נוירונים בהיפוקמפוס ניתן לגדל במדיום תרבות בסרום חינם שהוגדר על ידי שיתוף culturing אותם עם נוירונים בצפיפות גבוהים, ב באופן מקביל שיתוף תרבות נוירון, גליה אימצה כמקובל. אכן, תרבויות נוירון בהיפוקמפוס צפיפות גבוהה בתצורת 'סנדוויץ' שימשו לאחרונה לתמוך במספר קטן של נוירונים האנדוקרינית magnocellular מתמחה 12.
לכן, שיתוף תרבות עם נוירונים צפיפות גבוהים עלולה לאפשר נוירונים בצפיפות נמוכים כדי לקבל תמיכת גורמי trophic כי די בכך כדי לאפשר הישרדות לטווח ארוכה. פרוטוקול זה של נוירונים צפיפות נמוכה במיוחד culturing ובכך גובש ומאומת. הפרוטוקול יכול להיות מיושם בתוך ניסוי בודד אחד, על ידי הכנת צפיפות גבוהה (~ 250,000 תאים / מ"ל) דיסנוירונים בהיפוקמפוס sociated הראשון, ולאחר מכן ביצוע דילול להניב צפיפות ~ 10,000 נוירונים / מ"ל (~ 3,000 נוירונים / coverslip, או ~ 2,000 נוירונים / 2 ס"מ), שהוא הרבה יותר נמוך מאשר רוב דיווחו תרבויות בצפיפות נמוכה 2,3,9 , 11,13. מצב תרבות זה נקרא רופף כתרבות "אולטרה-נמוך צפיפות 'ומשתמש עם' בצפיפות נמוכה 'בין-changeably. הנוירונים הצפיפות הגבוהים הם מצופים על 24 גם צלחות פולי- D- ליזין מצופות; בעוד נוירונים בצפיפות נמוכה הם זורעים על coverslips זכוכית פולי- D- ליזין מצופה 12 מ"מ אשר ממוקמות בתוך אחר צלחת 24 גם. Coverslips עם הדבקות נוירונים בצפיפות נמוכה הם התהפכו על גבי נוירונים צפיפות הגבוהים 2 hr מאוחר יותר לאחר נוירונים הם צאצאים ומצורפים coverslips. בנוסף, במקום להשתמש נקודות פראפין לרומם את coverslips מעל שכבת נוירון צפיפות הגבוהה, מחט מזרק 18 G שמשה לחרוט בתחתית 24 הצלחות גם עם שני פסים מקבילים. Displ וכתוצאה מכךaced, פלסטיק הסמוך לספק תמיכה גבוהה עבור coverslips הזכוכית. שטח זה נמדד באופן עקבי 150-200 מיקרומטר, המאפשר בינוני חמצן והתרבות מספיק חליפין תוך מתן microenvironment עם גורמי trophic מרוכזים. תחת תנאי זה, הנוירונים בצפיפות הנמוכים לגדול בהרחבה, והוא יכול לשרוד מעבר לשלושה חודשים בתרבות. כאשר נוירונים אלה הם transfected עם פלסמיד GFP לאחר שלושה שבועות בתרבות, הדנדריטים משובצים למכביר עם הקוצים הדנדריטים. כהוכחה עקרוני, הנתונים מוצגים להראות כי מערכת שיתוף תרבות זו תומכת תרבויות צפיפות נמוכה במיוחד של נוירונים בהיפוקמפוס זורעים על '-איים מיקרו' פולי- D- ליזין, שבו יוצרים נוירונים קשרים autaptic שעשויים להקל חקירת התא -autonomous, מנגנוני רשת עצמאית.
Protocol
Representative Results
Discussion
אנו מציגים פרוטוקול מפורט לתרבות לטווח ארוך של נוירונים glutamatergic אולטרה-נמוך צפיפות בהיפוקמפוס בתנאים חופשית בסרום. ב ~ 2000 נוירונים / 2 ס"מ, הצפיפות היא לפחות שני לקפל נמוך יותר מאשר ברוב ההכנות תרבות 'צפיפות נמוכה "עם או בלי תמיכה גליה שדווח על ידי הספרות ה?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by an NIH/NIMH grant to S.Q. (R00MH087628).
Materials
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | Protect from light |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | aliquot, store in 0.6ml size |
| GlutaMAX-I | Life Technologies | 35050-061 | dilute 100X |
| antibiotic-antimycotic (AA) | Life Technologies | 15240-096 | dilute 100X |
| Complete Culture medium | Neurobasal medium with 1X B27, 1X AA, 1X GlutaMAX-I | ||
| Wash medium | same as 'Neurobasal medium' | ||
| Feed medium | Neurobasal with 1X B27 supplement | ||
| DNAse I | Sigma-Aldrich | D5025 | prepare 100X stock at 0.6mg/ml |
| poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | M.W. 70000-150000 |
| borate buffer | Sigma-Aldrich | B6768 (boric acid); 71997(borax) | 1.24g boric acid & 1.9g borax in 400ml H2O, pH to 8.5 use HCl |
| 12-mm round glass coverslips | Glasswarenfabrik Karl Hecht GmbH | 1001/12 | No. 1 glass, purchase from Carolina Biological Supply |
| proFection transfection kit | Promega | E1200 | see protocol for details |
| 2X HEPES buffered saline (HBS) | Promega | E1200 | see protocol for details |
| Syringe filter | Pall Corporation | 4192 | 0.2um pore size |
| Endofree plasmid prep kit | Qiagen | 12362 | for preparation of transfection grade plasmid DNA |
| anti-MAP2 antibody | Millipore | MAB3418 | mouse antibody, clone AP20 |
| anti-p-Tau antibody | Millipore | AB10417 | rabbit polyclonal antibody |
| anti-NR1 antibody | Millipore | MAB1586 | mouse antibody, clone R1JHL |
| anti-GluR1 antibody | Millipore | AB1504 | rabbit polyclonal antibody |
| Hank's balanced salt solution | ThermoFisher | 14025092 | 500ml size |
References
- Banker, G. . Cultureing Nerve Cells. , 339-370 (1998).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Petersen, J. D., Kaech, S., Banker, G. Selective microtubule-based transport of dendritic membrane proteins arises in concert with axon specification. J Neurosci. 34, 4135-4147 (2014).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. J Vis Exp. , (2012).
- Shi, Y., Ethell, I. M. Integrins control dendritic spine plasticity in hippocampal neurons through NMDA receptor and Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II-mediated actin reorganization. J Neurosci. 26, 1813-1822 (2006).
- Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. J Vis Exp. , (2011).
- Biffi, E., Regalia, G., Menegon, A., Ferrigno, G., Pedrocchi, A. The influence of neuronal density and maturation on network activity of hippocampal cell cultures: a methodological study. PLoS One. 8, e83899 (2013).
- Crump, F. T., Dillman, K. S., Craig, A. M. cAMP-dependent protein kinase mediates activity-regulated synaptic targeting of NMDA receptors. J Neurosci. 21, 5079-5088 (2001).
- Leal, G., Afonso, P. M., Duarte, C. B. Neuronal activity induces synaptic delivery of hnRNP A2/B1 by a BDNF-dependent mechanism in cultured hippocampal neurons. PLoS One. 9, e108175 (2014).
- Clarke, L. E., Barres, B. A. Emerging roles of astrocytes in neural circuit development. Nat Rev Neurosci. 14, 311-321 (2013).
- Kaneko, A., Sankai, Y. Long-term culture of rat hippocampal neurons at low density in serum-free medium: combination of the sandwich culture technique with the three-dimensional nanofibrous hydrogel PuraMatrix. PLoS One. 9, e102703 (2014).
- Millet, L. J., Bora, A., Sweedler, J. V., Gillette, M. U. Direct cellular peptidomics of supraoptic magnocellular and hippocampal neurons in low-density co-cultures. ACS Chem Neurosci. 1, 36-48 (2010).
- Salama-Cohen, P., Arevalo, M. A., Meier, J., Grantyn, R., Rodriguez-Tebar, A. NGF controls dendrite development in hippocampal neurons by binding to p75NTR and modulating the cellular targets of Notch. Mol Biol Cell. 16, 339-347 (2005).
- Xu, S. Y., Wu, Y. M., Ji, Z., Gao, X. Y., Pan, S. Y. A modified technique for culturing primary fetal rat cortical neurons. J Biomed Biotechnol. 2012, 803930 (2012).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
- Qiu, S., Weeber, E. J. Reelin signaling facilitates maturation of CA1 glutamatergic synapses. J Neurophysiol. 97, 2312-2321 (2007).
- Qiu, S., Lu, Z., Levitt, P. MET receptor tyrosine kinase controls dendritic complexity, spine morphogenesis, and glutamatergic synapse maturation in the hippocampus. J Neurosci. 34, 16166-16179 (2014).
