Ein vereinfachtes Verfahren für Ultra-Low Density, Long-Term Primäre Hippocampus Kultur

Hippokampus – Neuronen Anbau unter in vitro Bedingungen ermöglicht Beobachtungen und experimentelle Manipulation dieser Neuronen , die sonst nicht möglich sind , in vivo. Dieser experimentelle Ansatz ist weit verbreitet ¹ zu offenbaren neuronalen Mechanismen des Wachstums, der Polarität, Neuriten – Spezifikation, des Handels und der subzellulären Lokalisation von Proteinen, die Synapsenbildung und funktionelle Reifung verwendet. Diese in vitro kultivierten Hippocampus – Neuronen, wenn sie von späten embryonalen Stadien geerntet, sind relativ rein (> 90%) glutamatergen Zellen der Pyramiden Morphologie ^2. Da Neuronen in einer 2-D – Oberfläche unter in vitro Bedingungen gezüchtet wurden, ermöglicht diese Methode eine einfache Beobachtung, wie die Live – Darstellung oder Immunzytochemie (ICC) über eine einzige Brennebene Färbung ^3; oder Manipulationen, wie medikamentöse Behandlung und Transfektionen ^3-6. Wenn bei hoher Dichte gezüchtet, neigen Neuronen hohe Überlebensraten haben wegen der höheren Concentrations von sezernierten Wachstumsfaktoren zusätzlich zu Verdauungs Unterstützung der Wachstumsmedien und auch wegen der Neuriten kontaktabhängige Mechanismen ^7. Allerdings sind niedriger Dichte Neuronen im Hippocampus wünschenswert für morphologische Studien, in denen ein einzelnes Neuron kann in seiner Gesamtheit oder gebeizt für ICC-Analyse abgebildet werden. Geringer Dichte Neuronen sind schwer in Kultur zu halten aufgrund des Fehlens von parakrine Unterstützung und erfordern daher oft trophische Unterstützung von einer glialen (typischerweise kortikalen Astrozyten) feeder layer, die vor dem Neuron Kultur ² vorbereitet werden muss. Wenn co-kultiviert mit einer Gliazellen Feeder-Schicht, sind niedriger Dichte Neuronen auf Deckgläsern gezüchtet, und blätterte dann auf der Oberseite der Schicht Glia, so dass die geringe Dichte Neuronen und Gliazellen sind einander zugewandt sind. Ein kleiner begrenzten Raum zwischen Glia und Neuronen ist , indem Paraffinwachs Punkte an den Ecken der Deck erstellt, also eine "Sandwich" Layout ^2,8,9 erzeugen. Die geringe Dichte Neuronen wachsen wnnerhalb den engen Raum zwischen Gliazellen und dem Deckglas, das von Neuronen und Glia sezerniert eine permissive Mikro mit konzentrierter Faktoren erstellt. Dieser Ansatz führt zu geringer Dichte, voll entwickelten Neuronen, die einigermaßen voneinander entfernt sind, also ICC Kennzeichnung oder Live-Imaging-Studien erleichtern.

Ein scheinbarer Nachteil Neuron-Glia-Co-Kultur, abgesehen davon, dass zeitraubend und arbeitsaufwendig ist, dass es Studium der neuronenspezifische, oder zellautonomen, Mechanismen verhindert. Obwohl dieses System ist weit weniger komplex als in vivo Nervengewebe, Glia Auswirkungen auf neuron Entwicklung durch sezerniert noch-nicht-vollständig definierte Faktoren können die Experimente ¹⁰ vermengen. Daher wird in Experimenten, die die Untersuchung von Neuron spezifische Mechanismen erfordern, definierten Kulturbedingungen, die Serum und Glia-Trägerschicht erforderlich sind, zu entfernen. In einer früheren Studie wurde in Züchten niedrigen Konzentrationen von Neuronen (~ 9.000 Zellen / cm ²⁾ unter Verwendung eines th gelungenree dimensionale Hydrogelmatrix ^11. Da eine relativ reine kann neuronalen Population mit hoher Dichte unter serumfreien Bedingungen ohne glial Unterstützung kultiviert werden, hypothesize wir, dass ultra-niedrige Dichte von hippocampalen Neuronen in serumfreien definierten Kulturmedium durch Co-Kultivieren mit hoher Dichte Neuronen gezüchtet werden, in eine Möglichkeit, die der konventionell angenommen Neuron-Glia-Kokultur analog ist. Tatsächlich wurden hohe Dichte hippocampalen Neuronenkulturen in einer "Sandwich" -Konfiguration vor kurzem eine kleine Anzahl von spezialisierten magnozellulären endokrinen Neuronen ¹² zur Unterstützung verwendet wird .

Daher Co-Kultur mit hoher Dichte Neuronen erlauben kann niedriger Dichte Neuronen trophischen Faktoren Unterstützung zu erhalten, die langfristige Überleben zu ermöglichen, ausreichend ist. Dieses Protokoll der Kultivierung mit ultraniedriger Dichte Neuronen wurde so formuliert und validiert. Das Protokoll kann in einem einzigen Experiment durchgeführt, mit hoher Dichte Herstellung von (~ 250.000 Zellen / ml) disvergesellschafteten Neuronen im Hippocampus zuerst, und macht dann eine Verdünnung mit einer Dichte ~ 10.000 Neuronen zu erhalten / mL (~ 3.000 Neuronen / Deckglas oder ~ 2.000 Neuronen / cm ^2), die viel niedriger ist als in den meisten Kulturen mit geringer Dichte berichtet ^{2,3,9 , 11,13.} Diese Kultur Zustand lose bezeichnet als "ultra-niedriger Dichte" Kultur und verwendet mit "niedriger Dichte" inter-changeably. Die hohe Dichte Neuronen werden auf der Poly-D-Lysin beschichtete Platten mit 24 Vertiefungen plattiert; während die geringe Dichte Neuronen auf Poly-D-Lysin-beschichtete 12-mm Glasplättchen ausgesät werden, die in einem anderen 24-Well-Platte angeordnet sind. Die Deckgläser mit geringer Dichte Neuronen haften auf der Oberseite der hohen Dichte Neuronen 2 Stunden später gekippt, nachdem die Neuronen abstammen und auf die Deckgläser angebracht. Zusätzlich anstelle Paraffin Punkte der Verwendung zu erhöhen, wurde die Deckgläser über der hohen Dichte Neuronenschicht, eine 18 G Injektionsnadel verwendet, um den Boden der 24-Well-Platten mit zwei parallelen Streifen zu ätzen. Die resultierende displaced, angrenzende Kunststoffe bieten eine erhöhte Unterstützung für die Glasplättchen. Dieser Raum wird konstant auf 150 bis 200 & mgr; m gemessen, die ausreichend Sauerstoff und Kulturmedium Austausch ermöglicht, während eine Mikroumgebung mit konzentrierter Nahrungsfaktoren bereitstellt. Unter dieser Bedingung wachsen die niedriger Dichte Neuronen extensiv und über drei Monate in Kultur überleben können. Wenn diese Neuronen mit GFP-Plasmid nach drei Wochen in Kultur transfiziert sind, werden die Dendriten überschwänglich mit dendritischen Dornen besetzt. Als Beweis für das Prinzip werden die Daten zu zeigen, präsentiert, dass diese Co-Kultursystem mit ultraniedriger Dichte Kulturen von Neuronen im Hippocampus auf Poly-D-Lysine "Mikro-Inseln", wo Neuronen bilden autaptic Verbindungen ausgesät unterstützt die Untersuchung von Zell erleichtern -autonomous, netzunabhängige Mechanismen.