Анализ<em> В Vivo</em> Миграция клеток с использованием мобильных трансплантаций и время покадровой визуализации у эмбрионов данио рерио
Summary
Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.
Abstract
Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.
Introduction
В многоклеточных организмах, миграция клеток имеет важное значение как для развития эмбриона, где он обеспечивает организацию клеток в ткани и органы, а также для взрослой жизни, где он принимает участие в гомеостазе ткани (заживления ран) и иммунитета. В дополнение к этим физиологические функции, миграция клеток также участвует в различных патологических ситуациях, в том числе, в частности, раковых метастаз.
Миграция клеток была проанализирована в пробирке в течение многих десятилетий, обеспечивая общее понимание молекулярных механизмов , обеспечивающих движения клеток на плоских поверхностях. В естественных условиях , однако, клетки сталкиваются с более сложной среде. Это явно появились в последние годы, что миграция в организме может влиять внешние сигналы, такие как внеклеточный матрикс, соседние клетки или секретируемые хемокинов миграцию направляющих, и что механизмы, движущие миграции клеток может отличаться в зависимости от того, что было описано <EM> в пробирке 1,2. Механизмы , обеспечивающие в миграции естественных клеток уделялось меньше внимания до сих пор, в основном , из-за повышенной технической сложности, по сравнению с исследованиями в лабораторных условиях . В естественных условиях анализа миграции клеток , в частности , требует прямого оптического доступа к мигрирующие клетки, методы , чтобы маркировать уникальные клетки чтобы видеть их динамику и морфологию, а также усиление или потеря функции подходит для проверки роли генов-кандидатов. До сих пор лишь несколько модельных систем , несущие эти характеристики были использованы для рассекают в естественных условиях миграции клеток 3.
Недавно мы использовали миграцию перспективной прехордальной пластины в ранних эмбрионов данио рерио в качестве новой системы удобная модель для оценки функции генов – кандидатов в контроле миграции клеток естественных условиях 4,5. Перспективное прехордальная пластины (также известный как передний mesendoderm) представляет собой группу клеток, образующих в начале Gastrulation на спинной стороне зародыша. Во время гаструляции эта группа коллективно мигрирует к анимальной эмбриона 6-8, чтобы сформировать прехордальную пластину, mesendodermal утолщение, кпереди от хорды, и лежащие в основе нервной пластинки. Передняя часть прехордальной пластины будет приводить к инкубационной железы, в то время как его задняя часть , вероятно , способствует головы мезодермы 9. Благодаря внешнему развитию и оптической прозрачности рыбы эмбриона, миграция клеток может быть непосредственно и легко наблюдать в этой структуре.
Клеточная трансплантация является очень мощным методом , который позволяет быстро и легко создавать мозаики эмбрионов 10. Выражая флуоресцентные маркеры цитоскелета в трансплантированных клеток приводит в классификации выделенных клеток, морфологии и динамика которого можно легко наблюдать. В сочетании с потерей или усилением функции подходов позволяет анализировать клеточных автономных функций банкиdidate ген.
Представленный протокол описывает , как мы оценивали функцию компонента SIN1 TORC2 в контроле клеточной миграции и актина динамики в естественных условиях 5. Но, как уже упоминалось в результатах и дальнейшего обсуждения, он может быть использован для анализа потенциального импликации любого гена – кандидата в контроле миграции клеток в естественных условиях.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол представляет собой простой способ для изучения роли гена – кандидата в миграции клеток в живом организме , путем объединения создания химерных эмбрионов с использованием клеточной трансплантации с живого изображения.
Создание мозаики эмбрионов
<p c…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank F. Bouallague and the IBENS animal facility for excellent zebrafish care. Research reported in this publication was supported by the Fondation ARC pour la recherche sur le cancer, grants N° SFI20111203770 and N° PJA 20131200143.
Materials
| Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.58 mm) | Harvard Apparatus | 300085 | standard thickness |
| Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.78 mm) | Harvard Apparatus | 300085 | thin-walled |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | 10 000 units penicillin and 10 mg streptomycin per ml |
| fine tweezers | Dumont Fine Science Tools | 11254-20 | 5F |
| glass bottom dishes | MatTek | P35G-0-10-C | |
| Air transjector | Eppendorf | 5246 | |
| Micro-forge | Narishige | MF-900 | |
| Microgrinder | Narishige | EG-44 | |
| Micromanipulator (for injection) | Narishige | MN-151 | |
| Micromanipulator (for cell transplantation) | Leica | Leica Micromanipulator | |
| Hammilton Syringe | Narishige | IM-9B | |
| Micropipette puller | David Kopf Instruments | Model 720 | |
| Transplantation mold | Adapative Science Tools | PT-1 | |
| Needle holder | Narishige | HI-7 | |
| Tube connector | Narishige | CI-1 | |
| PTFE tubing | Narishige | CT-1 |
References
- Charras, G., Sahai, E. Physical influences of the extracellular environment on cell migration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 813-824 (2014).
- Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: A multiscale tuning model. Journal of Cell Biology. 188 (1), 11-19 (2010).
- Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature reviews. Molecular cell biology. 10 (7), 445-457 (2009).
- Dang, I., Gorelik, R., et al. Inhibitory signalling to the Arp2/3 complex steers cell migration. Nature. , (2013).
- Dumortier, J. G., David, N. B. The TORC2 Component, Sin1, Controls Migration of Anterior Mesendoderm during Zebrafish Gastrulation. Plos One. 10, e0118474 (2015).
- Solnica-Krezel, L., Stemple, D. L., Driever, W. Transparent things: cell fates and cell movements during early embryogenesis of zebrafish. BioEssays. 17 (11), 931-939 (1995).
- Ulrich, F., Concha, M. L., et al. Slb/Wnt11 controls hypoblast cell migration and morphogenesis at the onset of zebrafish gastrulation. Development. 130 (22), 5375-5384 (2003).
- Dumortier, J. G., Martin, S., Meyer, D., Rosa, F. M., David, N. B. Collective mesendoderm migration relies on an intrinsic directionality signal transmitted through cell contacts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 1-6 (2012).
- Gritsman, K., Talbot, W. S., Schier, A. F. Nodal signaling patterns the organizer. Development. 127 (5), 921-932 (2000).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. Journal of visualized experiments : JoVE. (29), (2009).
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. The Journal of Cell Biology. 209 (1), 163-180 (2015).
- Gorelik, R., Gautreau, A. Quantitative and unbiased analysis of directional persistence in cell migration. Nature Protocols. 9 (8), 1931-1943 (2014).
- Sacan, A., Ferhatosmanoglu, H., Coskun, H. CellTrack: An open-source software for cell tracking and motility analysis. Bioinformatics. 24 (14), 1647-1649 (2008).
- Tahinci, E., Symes, K. Distinct functions of Rho and Rac are required for convergent extension during Xenopus gastrulation. Developmental biology. 259 (2), 318-335 (2003).
- Zhang, T., Yin, C., et al. Stat3-Efemp2a modulates the fibrillar matrix for cohesive movement of prechordal plate progenitors. Development. 141 (22), 4332-4342 (2014).
- Riedl, J., Crevenna, A. H., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature methods. 5 (7), 605-607 (2008).
- Burkel, B. M., Von Dassow, G., Bement, W. M. Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin. Cell Motility and the Cytoskeleton. 64 (11), 822-832 (2007).
- Yoo, S. K., Deng, Q., Cavnar, P. J., Wu, Y. I., Hahn, K. M., Huttenlocher, A. Differential regulation of protrusion and polarity by PI3K during neutrophil motility in live zebrafish. Developmental cell. 18 (2), 226-236 (2010).
- Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis. Developmental biology. 393 (2), 209-226 (2014).
- Johnson, H. W., Schell, M. J. Neuronal IP3 3-kinase is an F-actin-bundling protein: role in dendritic targeting and regulation of spine morphology. Molecular biology of the Cell. 20 (24), 5166-5180 (2009).
- Yi, J., Wu, X. S., Crites, T., Hammer, J. A. Actin retrograde flow and actomyosin II arc contraction drive receptor cluster dynamics at the immunological synapse in Jurkat T cells. Molecular Biology of the Cell. 23 (5), 834-852 (2012).
