Handhaving van<em> Drosophila melanogaster</em> Bevolking Cage
Summary
This manuscript reports a detailed protocol for culturing, on a regular basis, a population of Drosophila melanogaster using a fly population cage.
Abstract
Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life cycle of Drosophila enables collection of large quantities of material from embryos, larvae, pupae and adult flies, in a synchronized way, at a low economic cost. A major strategy for propagating large numbers of flies is the use of a fly population cage. This useful and common tool in the Drososphila community is an efficient way to regularly produce milligrams to tens of grams of embryos, depending on uniformity of developmental stage desired. While a population cage can be time consuming to set up, maintaining a cage over months takes much less time and enables rapid collection of biological material in a short period. This paper describes a detailed and flexible protocol for the maintenance of a Drosophila melanogaster population cage, starting with 1.5 g of harvested material from the previous cycle.
Introduction
De mogelijkheid om genetische en biochemische methoden combineren Drosophila heeft in bijzondere mate geschikt organisme voor biochemie en moleculaire biologie studies 1-3. Deze studies vereisen vaak grote hoeveelheden biologisch materiaal, niet alleen van volwassen vliegen, maar ook van larven 4, 5 en poppen embryo 6-8. Om grote hoeveelheden materiaal te verkrijgen, onderzoekers gekweekte vliegen gebruik van grote containers bekend als "population kooien" vliegen. Deze kooien bestaan uit een cilinder van kunststof waarop een net op beide zijden van de invoering van het voedsel in de kooi zonder de vliegen ontsnappen mogelijk. Deze kooien kunnen zelfgemaakte 9-11 of gekocht van een bedrijf (zie tabel van specifieke materialen / apparatuur) zijn.
Een belangrijk voordeel van dit systeem grote aantallen vliegen groeien is dat de cyclus van de fruitvlieg 12 kan worden bestuurd op een wijze die alle vliegen ontwikkelen in een relatief gesynchroniseerde wijze. Deze synchronisatie wordt bereikt door het zaaien van nieuwe embryo's, het voeden van de larven / vliegen en het opofferen van de volwassen vliegen op precieze tijden. Met behulp van een gesynchroniseerde vlieg bevolking is vooral handig voor de ontwikkelingsbiologie studies 13.
Het begin van een nieuwe populatie kooi van enkele vliegen is een tijdrovend proces dat veel amplificatiecycli 9-11. Zelfs het gebruik van grotere containers als fly cultuur flessen of minicages, kan het hele proces voor de laatste maanden. Om deze tijdrovende stap te vermijden, veel Drosophila laboratoria regelmatig onderhouden dergelijke kooien. Dat het gemakkelijkst een nieuwe kooi uitgaande van een embryo van een reeds gevestigde populatie kooi starten. In het algemeen zijn de meeste laboratoria onderhouden wildkleur bevolking kooien, zoals Oregon R of Canton S. Dit handschrift bevat een gedetailleerd protocol te vliegen bevolking kooien te houden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Beginnend met 1,5 g materiaal kan een opbrengst van verzamelde embryo tussen 7 en 13 g per cyclus verkrijgen. Om een dergelijke hoeveelheid materiaal te krijgen is het belangrijk om de juiste kweekomstandigheden voor alle fasen van de vlieg cyclus te handhaven.
De belangrijkste parameters zijn temperatuur en vochtigheid, die 24 ° C en 35% moet zijn. Als deze twee parameters niet constant in de normale omgeving van het laboratorium gehouden, zou een mogelijkheid zijn om de vlieg kooi te plaatsen in een incubator of klimaatkamer. Andere protocollen aanbevolen 70% vochtigheid en een constante 24 uur licht-donker cyclus om de opbrengst van de geproduceerde eieren 9,10 verhogen. Echter houden de luchtvochtigheid ongeveer 35% voorkomt bacteriële besmetting, en omdat het doel van dit protocol is uitsluitend de handhaving van een populatie kooi, worden de vliegen in de normale lichte omgeving van het laboratorium gehouden.
Een ander belangrijk punt is om di houdensturbances de volwassen vliegen zo laag mogelijk. Het kan raadzaam zijn om de kooi op een locatie gescheiden van de vlieg kamer houden kruisverontreiniging van andere vliegen te voorkomen.
Het kweken van grote populaties van transgene en mutant vliegt wordt afgeraden, omdat het erg moeilijk om hun zuiverheid te behouden en ze kunnen uitgesproken afwijkend paring gedrag vertonen in grote populatie kooien 14.
Een mogelijk probleem bij het kweken van Drosophila in grote hoeveelheden is de aanwezigheid van andere organismen zoals mijten en / of schimmels, die strijden om het eten en daardoor de opbrengst aan geproduceerde eieren te beperken. Om dit te vermijden, is het zeer belangrijk om alle schoon te houden, het wassen van de kooi, netten en dozen vliegen met water en zeep en gooi de wegwerpmateriaal (schuimdoppen) na elke cyclus. Om schimmel te verminderen groeit, propionzuur en fosforzuur worden toegevoegd in de natte gist bij de voorbereiding van de vlieg voedsel in stap1.2 en Tegosept bij de voorbereiding van de melasse lade in stap 3.1. Het is soms handig om plaats materialen zoals plastic doos of zeven in -20 ° C wanneer de tijd is kort en materialen kunnen niet direct worden gereinigd.
Een hele verzamelcyclus optreedt in 14-15 dagen, beginnend bij de embryo's worden uitgezet in de box vliegen en eindigend met de laatste lichting dag. Gedurende deze periode, is het raadzaam om een schema te organiseren om alle nodige maatregelen voor het behoud van een populatie vlieg kooi (afb. 2), beschreven in het gedeelte protocol herinneren. Vanaf de dag dat de eieren worden uitgezet, totdat de volwassen vliegen komen, dient alleen te inspecteren de plastic doos, en wanneer verpopping plaatsvindt, te plaatsen in de kooi. Daarna de vliegen moeten worden gevoed om 2-3 dagen tot embryo's worden geënt voor een nieuwe cyclus. In het gehele protocol, de langste dag bij het verzamelen en zaaien van de embryo's voor het starten van een nieuwe cyclus. EENs commentaar in het protocol, de beste ei opbrengst is 3-5 dagen na volwassen Eclosion, en ten slotte daalt 2 dagen later. Dit geeft ons enige flexibiliteit om de dag waarop de oogst van de eieren wordt uitgevoerd kiezen.
Als om welke reden dan ook de opbrengst van de verzamelde embryo's minder dan de gewenste basisbedrag (1,5 g) is, kan men altijd een nieuwe melasse bak toe te voegen en het verzamelen van meer eieren de volgende dag. Voor constante verzamelingen, is het aanbevolen om 2 kooien parallel behouden en indien grotere hoeveelheden embryo vereist, is het ook mogelijk om grotere kooien gebruiken. Bij het doen van een verzameling korte tijd, een manier om de opbrengst te verhogen is om te profiteren van de eierleggende burst in de ochtend.
Er zijn vele voordelen van het verzamelen van grote hoeveelheden van verschillende ontwikkelingsstadia. Zo verzamelde embryo's populatie kooien zeer succesvol gebruikt in immunoprecipitatie assays 6-8, massa collection van larvale weefsel van gedissocieerde larven heeft aangetoond een zeer goede bron voor 3C experimenten 4 en RNA preparaten 15 en koppen volwassen vliegen zijn gebruikt voor ChIP experimenten 16. Bovendien zijn volwassenen vaak nodig om vliegen extracten maken weefselkweek 17.
Een van de meest veelbelovende toepassingen van de kooi om materiaal voor high-throughput assays die de analyse en screening van genen, transcripts, eiwitten en metabolieten toe als reactie op de blootstelling van ziekteverwekkers, biologische moleculen, chemische stoffen en ioniserende straling. In deze grootschalige assays grote aantallen individuen vereist, en de vliegenpopulatie kooi beschreven kan zeer nuttig zijn om grote hoeveelheden materiaal in de verschillende fasen van de levenscyclus Drosophila hun analyse en screening 18 verkrijgen.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Yixian Zheng (Carnegie Institution of Washington, Baltimore, MD) for the original protocol and assistance in initial setup and members of the Lei laboratory for critical reading of the manuscript. This work was funded by the Intramural Research Program of the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases.
Materials
| Bacto-Agar | Beckton Dickinson | 214010 | |
| Curity practical cotton roll | Kendall | 2287 | |
| Dry yeast | Affymetrix | 23540 | |
| Filter paper | GE Healthcare Life Science | 1001-085 | |
| Foam tube plugs | Jaece | L800-D2 | 50 mm Diameter x 55 mm Length |
| Fly population cage | Flystuff | 59-116 | 9″ Diameter x 14.4″ Length. Includes the nets for the cage. |
| Meat tray | Genpak | 1002S (#2S) | 8.25 x 5.75 x 0.5 inches |
| Molasses | Grandma´s | ||
| Plastic container | Rubbermaid | 4022-00 | |
| Plastic film | Glad | ||
| Phosphoric acid | Fisher Scientific | S 93326 | Toxic. Handle in Chemistry Hood |
| Propionic acid | Fisher Scientific | A258-500 | Toxic. Handle in Chemistry Hood |
| Stainless steel sieve #100 | VWR | 57324-400 | |
| Stainless steel sieve #40 | VWR | 57324-272 | |
| Stainless steel sieve #30 | VWR | 57324-240 | |
| Sucrose | MP | 152584 | |
| Tegasept | LabScientific | FLY5501 | |
| Triton-X100 | Fisher Scientific | BP151-500 |
References
- Lim, S. J., Boyle, P. J., Chinen, M., Dale, R. K., Lei, E. P. Genome-wide localization of exosome components to active promoters and chromatin insulators in Drosophila. Nucleic Acids Res. 41, 2963-2980 (2013).
- Ong, C. T., Van Bortle, K., Ramos, E., Corces, V. G. Poly(ADP-ribosyl)ation regulates insulator function and intrachromosomal interactions in Drosophila. Cell. 26, 148-159 (2013).
- Gonzalez, I., Mateos-Langerak, J., Thomas, A., Cheutin, T., Cavalli, G. Identification of regulators of the three-dimensional polycomb organization by a microscopy-based genome-wide RNAi screen. Mol Cell. 8, 485-499 (2014).
- Magbanua, J. P., Runneburger, E., Russell, S., White, R. A variably occupied CTCF binding site in the ultrabithorax gene in the Drosophila bithorax complex. Mol Cell Biol. 35, 318-330 (2014).
- Maksimenko, O. Two new insulator proteins, Pita and ZIPIC, target CP190 to chromatin. Genome Res. 25, 89-99 (2015).
- Lei, E. P., Corces, V. G. RNA interference machinery influences the nuclear organization of a chromatin insulator. Nat Genet. 38, 936-941 (2006).
- Matzat, L. H., Dale, R. K., Moshkovich, N., Lei, E. P. Tissue-specific regulation of chromatin insulator function. PLoS Genet. 8, e1003069 (2012).
- King, M. R., Matzat, L. H., Dale, R. K., Lim, S. J., Lei, E. P. The RNA-binding protein Rumpelstiltskin antagonizes gypsy chromatin insulator function in a tissue-specific manner. J Cell Sci. 1, 2956-2966 (2014).
- Sisson, J. C. Culturing large populations of drosophila for protein biochemistry. Cold Spring Harb Protoc. , (2007).
- Shaffer, C. D., Wuller, J. M., Elgin, S. C. Raising large quantities of Drosophila for biochemical experiments. Methods Cell Biol. 44, 99-108 (1994).
- Roberts, D. B., Standen, G. N., Roberts, D. B. The elements of Drosophila biology and genetics. Drosophila: A practical approach. , 1-53 (1998).
- Ashburner, M., Roote, J. Culture of Drosophila: The laboratory setup. Cold Spring Harb Protoc. , (2007).
- Dahlberg, O., Shilkova, O., Tang, M., Holmqvist, P. H., Fb Mannervik, M. P-TEb, The super elongation complex and mediator regulate a subset of non-paused genes during early Drosophila embryo development. PLOS Genet. 13, e1004971 (2015).
- Zhang, S. D., Odenwald, W. F. Misexpression of the white (w) gene triggers male-male courtship in Drosophila. Proc Natl Acad Sci USA. 6, 5525-5529 (1995).
- Chak, L. L., Mohammed, J., Lai, E. C., Tucker-Kellogg, G., Okamura, K. A deeply conserved, noncanonical miRNA hosted by ribosomal DNA. RNA. 21, 375-384 (2015).
- Moshkovich, N., Lei, E. P. HP1 recruitment in the absence of argonaute proteins in Drosophila. PLOS Genet. 12, e1000880 (2010).
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol Rev. 63, 411-436 (2011).
