Normen voor Quantitative Metalloproteomic analyse met behulp van Size Exclusion ICP-MS

1. Bereiding van Buffers en voorbeelden Bereid 500 ml buffer, 200 mM ammoniumnitraat pH 7,6-7,8 (pH ingesteld met ammoniumhydroxide (NH4OH)) met cesium (Cs) en antimoon (Sb) toegevoegd tot een uiteindelijke concentratie van 10 ppb. Gebruik cesium en antinomy als interne standaarden om te letten op drift in de reactie van ICP-MS. Filter buffer vóór gebruik door een 0,22 urn filter. Bereid monster afhankelijk van het type monster: vloeistof, weefsel- of celkweek. Voor monsters die homogenisatie (bijvoorbeeld weefsel of cellen) nodig, zodat zij geen detergens bevat. Gebruik Tris buffers voor de monstervoorbereiding. U kunt ook gebruik maken van fosfaat buffers, maar ze kan een negatieve invloed hebben op de metalloproteome na verloop van tijd of met vries dooi cycli 12. Homogeniseren weefsel of celkweek monsters handmatig dounce of sonicatie gedurende 5 min met behulp van Tris gebufferde zoutoplossing (50 mM Tris pH 8,0, 150 mM natriumchloride(NaCl) + ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) gratis proteaseremmers). Verduidelijken homogenaten door centrifugatie bij 16.000 xg gedurende 5 minuten. Verzamel de resulterende supernatant. Houd monsters bij 4 ° C. Opmerking: Alle monsters worden gecentrifugeerd voorafgaand aan het laden in de hoge prestatie vloeistofchromatografie (HPLC) flacons dat deeltjes zal gaan blokkeren de kolom grootte-uitsluitingschromatografie (SEC). Normaliseren van de totale hoeveelheid eiwit geladen op de kolom over de monsters. Eiwitconcentraties bepaald bij 280 nm met een UV spectrofotometer microvolume 13. Belasting tussen 20 en 150 ug eiwit. Met typische injectievolumes variërend 2-80 gl afhankelijk van de monsterconcentratie. Maak de steekproef arm van de micro volume UV spectrofotometer met gedestilleerd water voordat monster laden. Het monster arm is wanneer het eiwit monsters worden geladen. Blanco het instrument tegen 2 pl the sample buffer. Laad dan 2 gl van elk monster op de arm en meet de absorptie bij 280 nm. Wordt de concentratie. Voor ruw eiwit monsters, maken gebruik van een extinctiecoëfficiënt van 1 Abs = 1 mg / ml. Om de concentratie van eiwit in de monsters te bepalen, gebruikt de Beer-Lambert wet, A = ε xlxc, waarin A de absorptie, ε de extinctiecoëfficiënt, l de weglengte in centimeters en c de concentratie. 2. Bulk Analyse van metalloproteïne Standards gebruik van inductief gekoppeld plasma – massaspectrometrie Warm-up en tunen van het instrument met behulp van de protocollen van de fabrikant. Zodra instrument wordt opgewarmd en afgestemd, voert bulk ICP-MS. Opmerking: De oplossingen van gezuiverd metalloproteïnen het algemeen moet worden verdund voor de meting. De metalen concentratie van de standaard kan worden geschat op basis van de bekende eiwit: metaal stochiometries en de geschatte eiwit Concentratie. Deze informatie kan worden gebruikt om de verdunning die passend binnen het bereik van de standaardkromme gegenereerd vallen zal bepalen. Verdun metalloproteïne normen, thyroglobuline, ferritine, ceruloplasmine, Cu / Zn SOD en vitamine B 12, zodat ze binnen het bereik van 0 vallen – 500 ug / L, middels 1% salpeterzuur. Normen bereiken binnen dit bereik, niet meer dan 1 verdunningen gebruiken 20. Voer seriële verdunningen in water om de voorraad te verdunnen voordat deze indien nodig. Stel de volgorde van de injecties. Eerst, analyseren de kalibratie zeven niveaus concentraties variërend 0-500 ug / l, gevolgd door de metalloproteïne normen. De zeven kalibratie niveaus 0, 1, 5, 10, 50, 100 en 500 ug / L. Selecteer elementen van belang. Hier, Gebruik Fe, Cu, Zn, Co en ik, omdat ze de elementen die de eiwitstandaarden zijn gebonden. Selecteer de elementen in de overnamemethode door het openen van de tab element selector en vervolgens die eleme gen en hun isotoop massa's die moeten worden geanalyseerd. Voeren monsteranalyse het instrument en het instrument software automatisch de kalibratiekrommen voor elke van de elementen worden geanalyseerd. De kalibratiekrommen worden gecreëerd door de software van het uitzetten van de tellingen / sec van de gedetecteerde tegen de hoeveelheid metaal die de norm is bedoeld om te bevatten, in mg / l metal. Met de kalibratiekromme om de concentratie van metaal bepalen de onbekende monsters. Opmerking: De ijkkromme, de software bepaalt de concentratie van metaal in elke metalloproteïne normen. Uit de totale analyseresultaten genereren metalloproteïne normen die de drie meest voorkomende spoorelementen in zoogdierlijke weefsels met een mengsel van Cu omvatten, Zn superoxide dismutase (SOD) verdund tot 200 ug / l koper en zink en ferritine (FTN) in een uiteindelijke concentratie van 2000 ug / l ijzer. jove_title "> 3. HPLC System Setup en Size Exclusion Chromatography kolomequilibratiebuffer Opmerking: Dit deel moet worden uitgevoerd parallel aan de vorige, aangezien ze allebei vereist ongeveer 1-1,5 uur in beslag. Purge HPLC pompen met buffer in stap 1,1 en ontlucht de pompen gedurende 5 min bij een stroomsnelheid van 5 ml / min. Zodra het systeem is verwijderd, ligt het debiet 0,1 ml / min en sluit de gelfiltratiekolom (4,6 x 300 mm, 3 urn, 150 A). Opmerking: Een natte verbinding tussen de buis en de kolom voorkomt eventuele luchtbellen gevangen tijdens het aansluiten van de kolom. Sluit het andere uiteinde van de kolom om de UV-detector ingesteld op 280 nm absorptie bij gebruik PEEK buis te meten. Geleidelijk verhogen van de stroomsnelheid van de kolom in stappen van 0,05-0,1 ml / min tot een uiteindelijke stroomsnelheid van 0,4 ml / min bereikt. Terwijl dit zich voordoet, controleert u de slangaansluitingen aan de kolom op eventuele lekkages. Bewaken van de drukvan het systeem waardoor het apparaat niet overschrijdt kolom eisen en houdt de druk spoor op het chromatogram in de software. Laat de kolom in evenwicht komen met de vereiste debiet meer dan 5-10 kolomvolumes. Nadat het is in evenwicht gebracht, sluit u de instrumenten om het monster analyse plaatsvinden. Stel de HPLC-methode tot buffer A overpompen de kolom bij 0,4 ml / min gedurende 15 min. 4. opzetten en runnen van Size Exclusion – inductief gekoppeld plasma – massaspectrometrie Opmerking: Operationele procedures kan variëren tussen de instrumenten en modellen. Neem contact op met het instrument technisch specialist voor meer informatie over het configureren van de ICP-MS wordt gebruikt te leren. Plaats de ICP – MS in de standby-modus voor de hardware-instelling te wijzigen. Eenmaal in de standby-modus schakelt u de communicatie voor de auto-sampler en verander de sample kennismaking met "andere". Opmerking: Afhankelijk van de software en hardware configuratie selecteren "HPLC" als monsterintroductiemethode bron kan worden gebruikt. Neem contact op met het instrument technisch specialist om te weten of deze optie beschikbaar is. Gebruik PEEK buis (ID 0,13 mm) om de stroom van de UV-detector rechtstreeks aansluiten op de vernevelaar op de ICP-MS. Power back-up van de ICP – MS en laat het apparaat opwarmen 10-20 min. Nadat het plasma ontstoken is, sluit de externe kabel van de ICP – MS naar de achterkant van de HPLC-autosampler. Doe dit zodra het plasma ontstoken; anders wordt het HPLC-systeem automatisch uitgeschakeld omdat de ICP – MS is niet op. Verander de ICP-MS methode om gegevens voor LC-ICP-MS verzamelen. Alter de overname methode van spectrum tot tijd resolve acquisitie (TRA). Selecteer de te analyseren elementen, Fe, Cu, Zn, Co, I, alsmede andere elementen van belang, en stel integratietijden (typisch tussen 0,05-0,3 sec). Na de elementen van belang eenre gekozen, past de overname tijd om de looptijd match voor de chromatografie (bijvoorbeeld 900 seconden voor een 15 min chromatografie run). Hand af te stemmen ICP – MS gevoeligheid en botsingscel helium (He) gasstroomsnelheid met chromatografie buffer stroomt via Cs en Sb in de buffer. De He stroomsnelheden zijn gewoonlijk ~ 1 ml / min lager dan die voor bulkanalyse. Zodra het metaalion tellingen gestabiliseerd en relatieve standaardafwijking (RSD) waarden lager dan 5%, is het systeem klaar voor gebruik. Maak monster lopen lijsten in zowel de HPLC en ICP-MS software programma's. Het monster run lijst bevat de volgorde waarin elk van de monsters is zo goed worden geïnjecteerd als de naam waarmee de gegevens worden opgeslagen. Controleer of het totale aantal monsters in de lijst wedstrijd tussen de twee programma's. Start de monsterbatch voor de ICP-MS voor de HPLC als de injectie van het monster door HPLC wordt de ICP leiden – MS wil bijhoudengegevens. Als dit niet in de juiste volgorde wordt gedaan zal leiden tot ontbrekende gegevens. Genereren kalibratiekromme punten door het injecteren van uiteenlopende hoeveelheden van de SOD en FTN gemengde standaard van 200 ug / l tot 6000 ug / L geïnjecteerd op de kolom voor Cu en Zn en 2000 ug / L tot 60.000 ug / L Fe. Injectie volumes variëren van 1 tot 30 pi. Opmerking: deze concentratiebereiken omvatten de concentratie van Fe, Cu en Zn typisch waargenomen in complex homogenaten. Voor monsters die alleen gezuiverde eiwitten bevatten het maximale bereik van de curve dienovereenkomstig moet worden aangepast. Wanneer de hoeveelheid metaal geassocieerd met het eiwit kan een kleiner of groter bereik worden omdat er minder vervuiling van het monster van andere factoren. Analyseer elke onbekende weefselmonsters, plasma of celkweek. 5. Data-analyse, manipulatie en visualisatie Sla de gegevens in de door komma's gescheiden waarden (csv) bestandsformaat en laad inom verwerkingsprogramma's zoals vereist. Om te controleren voor instrument drift, verdeel de tellingen per seconde voor elk element van de tellingen per seconde voor zowel Cs of Sb. Genereer kalibratiecurven voor elk van de elementen. Bepaal het oppervlak onder de metalen piek die overeenkomt met de metalloproteïne die aan elk van de injecties wordt gebonden door het uitvoeren piekintegratie de voorkeur gegevensanalyse software. Plot het gebied onder de metalen piek ten opzichte van de totale hoeveelheid van het metaal dat op de kolom werd geïnjecteerd in elke run, 200 – 6000 ug / l voor Cu en Zn en 2000 – 60.000 ug / L Fe. Voer lineaire regressieanalyse met de softwareprotocol. Met de resultaten helling van de lineaire regressieanalyse als factor tellingen per seconde omzetten pg / sec. Verdeel elk van de tellingen per seconde data locaties in het chromatogram door het stijgingspercentage van de lijn waarde. Grafiek van de gegevens inpg / sec tegen de chromatogram tijd. Bepaal het oppervlak onder de pieken van belang. Het oppervlak van de piek geeft de totale hoeveelheid metaal dat het eiwit is gebonden aan, in pg. Genereer een ijking op basis van het molecuulgewicht van de bekende metalloproteïnen en het tijdstip waarop ze elueren. Gebruik de omvang van de eiwitpieken schatten complexe monsters.