כימות פילמנטיות אקטין (F- אקטין) puncta ב עכברוש נוירונים קליפתיים
Summary
Filamentous actin (F-actin) plays an important role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Quantification of F-actin puncta is therefore a useful tool to study the integrity of synaptic structures. This protocol describes the procedures of quantifying F-actin puncta labeled with Phalloidin in low-density primary cortical neuronal cultures.
Abstract
חלבון אקטין פילמנטיות (F- אקטין) ממלא תפקיד מרכזי spinogenesis, הפלסטיות הסינפטית, ויציבות הסינפטי. שינויים במבנים להציע שינויים עשירים F- יקטינו הדנדריטים ביושרה הסינפטי וקישוריות. כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור culturing נוירונים בקליפת המוח עכברוש העיקרי, מכתים Phalloidin עבור puncta F- אקטין, וטכניקות כימות שלאחר מכן. ראשית, קליפת המוח הקדמית של עוברי חולדה E18 הם ניתק לתוך תרבית תאים בצפיפות נמוכה, אז הנוירונים לגדל במבחנה עבור 12-14 ימים לפחות. בעקבות הטיפול הניסיוני, הנוירונים בקליפת המוח מגואלות AlexaFluor 488 Phalloidin (לתייג את puncta F- אקטין הדנדריטים) ו-הקשורים microtubule חלבון 2 (MAP2; כדי לאמת את תאים עצביים ויושרה הדנדריטים). לבסוף, תוכנה מיוחדת משמשת כדי לנתח ולכמת שנבחרו באקראי דנדריטים עצביים. F- תקטין מבנים עשירים מזוהים על ענפי הדנדריטים מסדר השני (טווח אורך 25-75 &# 181; מ ') עם immunofluorescence MAP2 הרציף. הפרוטוקול המובא כאן יהיה שיטה שימושית חוקר שינויים במבני סינפסה הדנדריטים לאחר טיפולים ניסיוניים.
Introduction
המטרה העיקרית של המחקר היא לפתח שיטה אמינה של מדידה (אמידה) של שלמות הסינפטי של רשת הדנדריטים העצבית. כאן אנו מתארים כימות של puncta F- אקטין ב נוירונים בתרבית עכברוש ראשוני באמצעות שילוב של מכתים Phalloidin ו immunocytochemical (ICC) זיהוי של דנדריטים עם לניתוח שלאחר מכן באמצעות מיוחדים (ש"ח- Elements) תוכנה.
יש תווית phallotoxins זיקה דומה חוטים גדולים וקטנים כאחד (F- אקטין) אבל לא להיקשר אקטין כדוריים monomeric (G אקטין), בניגוד לכמה נוגדנים אקטין 1. ספציפי המחייב של Phalloidin זניח, ובכך לספק רקע מינימלי במהלך הדמיה הסלולר. Phalloidin הוא קטן בהרבה נוגדנים יאפיין לתייג חלבונים תאיים עבור מיקרוסקופ פלואורסצנטי, המאפשר תיוג הרבה יותר אינטנסיבי של F- אקטין ידי Phalloidin. לפיכך, תמונות מפורטות של לוקליזציה F- אקטין בנוירונים יכול להיותהמושגים תוך כדי שימוש של Phalloidin שכותרתו.
Phalloidin (F- יקטין) מכתים של דנדריטים עצביים מייצר "נקודות חמות" בדידות או בהיר "puncta", אשר מייצגות מגוון הרחב של מבנים הדנדריטים, כוללים קוצים בוגרים, סינפסות הלא קוצניות 2 קוצים בשלה. הקוצים בשלה כוללים filopodia דק וכמה צורות של מורפולוגיה תיקון, עשוי לייצג את החניכה של spinogenesis 3. קוצים בשלה וטלאים הלא קוצניים חסרי PSD95 4. שינויים בייצור של F- אקטין להוביל לשינויים שלאחר מכן לא הקוצים, אלא גם מבנים הדנדריטים נוספים, ובכך Phalloidin כלי חשוב לחקירת שלמות synaptodendritic 5-7. באופן כללי, מספר Phalloidin החיובי (F- יקטין) puncta לשקף איזון בין הסינפסות פעילה (מעורר ו מעכבות), דינמיקה תקטין סינפסה יציבות 8.
למרות שחשוב ללמוד t הספציפיypes של סינפסות (כלומר, קוצים מעוררים), כאשר היעד של הטיפול אינו ידוע יש צורך להעריך את היושרה הכללית הראשונה של מגוון מבנים הדנדריטים. מאז F- אקטין מהווה מרכיב מרכזי של הקוצים הדנדריטים ומבנים אחרים, כולל סינפסות מעכבות, מספר שינו של F- אקטין puncta עשוי להצביע על synaptopathy. synaptopathy לאחר מכן יהיה אפשר מתחקיר לשינויים ספציפיים יותר. שיטת כימות שלנו לאיתור סוגים הסינפטי מרובים / מבנים מניבים הערכה כללית של שינויי סינפטיים הדנדריטים (עליות וירידות) בעקבות טיפולים ניסיוניים שונים.
Protocol
Representative Results
Discussion
בפרוטוקול זה, אנו מתארים culturing נוירונים בקליפת המוח עכברוש בצפיפות נמוכה במנות 35 מ"מ זכוכית התחתונה אשר מאפשר לנו לזהות דנדריטים של נוירונים בודדים. לאחר מכן, אנו משתמשים Phalloidin ו MAP2 מכתים כדי לזהות שינויים הדנדריטים. לאחר מכן, השתמשנו בתוכנה מיוחדת כדי לכמת שינויים…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by NIH grants DA013137, DA031604, and HD043680. Partial support was provided by a NIH T32 training grant in Biomedical-Behavioral science.
Materials
| 35 mm Glass Bottom Dishes No. 1.5 coverglass | MatTek Corporation | P35G-1.5-20-C | |
| DMEM/F12 medium | Life Technologies | 10565-018 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P9155 | |
| Boric acid | Sigma | B0252 | |
| Borax | Sigma | B9876 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | 100X |
| Glucose | VWR | 101174Y | |
| HBSS | Sigma | H4641 | 10X |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| B-27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | 50X |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Cellgro | 30004CI | 100X |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080 | |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments | 500086 | |
| Iris Scissors | World Precision Instruments | 500216 | |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Dumont #7 Forceps | World Precision Instruments | 14097 | |
| Dumont #5 Forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| ProLong Gold | Life Technologies | P36930 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Cover glass | VWR | 631-0137 | |
| AlexaFluor 488 Phalloidin | Life Technologies | A12379 | |
| Normal horse serum | Life Technologies | 26050-070 | |
| Chicken polyclonal anti-MAP2 | abcam | Ab92434 | |
| Alexa Red 594-conjugated goat anti-chicken IgG | Life Technologies | A11042 | |
| NucBlue Live cell stain ReadyProbes Reagent Hoescht 33342 | Life Technologies | R37605 | |
| NIS-Elements software package | Nikon Instruments | ||
| Nikon Eclipse TE2000-E inverted fluorescent computer-controlled microscope | Nikon Instruments | ||
| 0.2 μm Nalgene nylon membrane filter | Fishersci | 151-4020 |
References
- Heller, E.A., et al. The biochemical anatomy of cortical inhibitory synapses. PLoS One. 7, e39572 (2012).
- Craig, A. M., Blackstone, C. D., Huganir, R. L., Banker G. Selective clustering of glutamate and gamma-aminobutyric acid receptors opposite terminals releasing the corresponding neurotransmitters. Proc Natl Acad Sci USA. 91, 12373-12377 (1994).
- Johnson, O. L., Ouimet, C. C. A regulatory role for actin in dendritic spine proliferation. Brain Res. 1113, 1-9 (2006).
- Rao, A., Craig, A. M. Signaling between the actin cytoskeleton and the postsynaptic density of dendritic spines. Hippocampus. 10 (5), 527-41 (2000).
- Matus, A., Ackermann, M., Pehling, G., Byers, H.R., Fujiwara, K. High actin concentrations in brain dendritic spines and postsynaptic densities. Proc Natl Acad Sci USA. 79, 7590-7594 (1982).
- Allison, D.W., Gelfand, V.I., Spector, I., Craig, A.M. Role of actin in anchoring postsynaptic receptors in cultured hippocampal neurons: differential attachment of NMDA versus AMPA receptors. J Neurosci. 18, 2423-2436 (1998).
- Sekino, Y., Kojima, N., Shirao, T. Role of actin cytoskeleton in dendritic spine morphogenesis. Neurochem Int. 51, 92-104 (2007).
- Zhang W., Benson, D. L. Stages of synapse development defined by dependence on F-actin. J Neurosci. 21 (14), 5169-81 (2001).
- Bertrand, S.J., Aksenova, M.V., Mactutus, C.F., Booze, R.M. HIV-1 Tat protein variants: Critical role for the cysteine region in synaptodendritic injury. Exp Neurol. 248, 228-35 (2013).
- Bertrand, S.J., Mactutus, C.F., Aksenova, M.V., Espensen-Sturges, T.D., Booze, R.M. Synaptodendritic recovery following HIV Tat exposure: neurorestoration by phytoestrogens. J Neurochem. 128(1), 140-51 (2014).
- Lau, P.M., Zucker, R.S., Bentley, D. Induction of filopodia by direct local elevation of intracellular calcium ion concentration. J Cell Biol. 145, 1265-1275 (1999).
