Администрирование и обнаружения меток белка на членистоногих для разгона исследований
Summary
Proteins are often used to mark arthropods for dispersal research. Methods for administering internal and external protein marks on arthropods are demonstrated. Protein mark detection techniques, either through indirect or sandwich enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs), are also illustrated.
Abstract
Мониторинг движения членистоногих часто требуется, чтобы лучше понять динамику популяции, связанные, разгон модели, предпочтения растений-хозяев, и другие экологические взаимодействия. Членистоногие, как правило, отслеживаются в природе помечая их с уникальным знаком, а затем повторно собирать их в пространстве и времени, чтобы определить их возможности расселения. В дополнение к реальным физическим тегов, таких как цветной пыли или краски, различные виды белков оказались очень эффективными для маркировки членистоногих экологических исследований. Белки могут быть введены внутри и / или снаружи. Белки могут быть обнаружены на пойманных членистоногих с белком конкретных иммуноферментного анализа (ELISA). Здесь мы опишем протоколов внешне и внутренне пометки членистоногих с белком. Два простых экспериментальные примеры продемонстрированы: (1) внутренний знак белок представлен насекомого путем предоставления содержанием белка, обогащенного и (2) внешний знак белка местноpplied к насекомым с использованием медицинской распылитель. Мы тогда связать шаг за шагом руководство бутерброда и косвенных методов ELISA, используемых для обнаружения белка знаки на насекомых. В этой демонстрации, различные аспекты приобретения и обнаружения белковых маркеров на членистоногих для марки-релиз-повторной поимки, марки-захвата и типы самостоятельной знак захвата исследований обсуждаются, наряду с различными способами, что процедура immunomarking Был адаптированы к широкий спектр задач исследования.
Introduction
Отслеживание перемещений членистоногих вредителей, естественных врагов (паразитов и хищников) и опылителей в природе имеет важное значение для лучшего понимания, как улучшить экосистемные услуги. Ключевым компонентом для большинства типов разгона исследований, имеющих надежный способ, чтобы отметить членистоногих (ы) интересов. Разнообразие материалов (например, краски, красители, цветные пыли, теги, редкие элементы, белки) были использованы, чтобы отметить членистоногих, чтобы оценить их динамику народонаселения, разгон возможности, кормление поведения и другие экологические взаимодействия 1,2.
Адекватность используемого маркера для любого заданного рассеивания исследований будет зависеть от типа исследования, проводимого. Есть три основных категоризация для маркировки членистоногих: (1) знак-релиз-повторной поимке (МРТ), (2) отметка-захвата, и (3) самостоятельно знак-захвата. Для разметки релиз-повторной поимке исследования, следователь, как правило, отмечает членистоногих вместе в laboratoры и освобождает их в центральной точке поля. Членистоногих затем отбили на различных пространственных и временных интервалов с помощью различных устройств сбора (например, чистый развертки, вакуумные, липкая ловушка) 3,4,5. В повторно пойманной особи затем проверяют на конкретный знак, чтобы отличить освобожден от родных лиц. Для исследования знака захвата, следователь, как правило, применяется знак непосредственно в поле, используя распыления (например, рюкзак распылителя, стрелы и сопла распылителя). Лучшие маркеры для исследования марка захвата недороги и легко наносится на среду обитания членистоногих в. Для исследования самостоятельно знак захвата, следователь, как правило, применяется знаки на членистоногих приманки 6,7 или гнездо входа 8. В свою очередь, членистоногие знаменует собой внутренне пожирая заметное приманку или внешне "чистки" против отметки, когда он выходит из гнезда.
Как упоминалось выше, многие виды маркеров были намиред пометить различные членистоногих. Тем не менее, очень немногие являются полезными для всех трех этих разгона исследовательских категорий. Развитие процедуры белок immunomarking был крупный прорыв для маркировки насекомых. Immunomarking ставит метку белка на членистоногих внутри или снаружи, который, в свою очередь, обнаруживает анти-белка специфического иммуноферментного анализа (ИФА). Первые маркеры, такие белковые были использованы кроличьим иммуноглобулином (IgG) и куриный IgG / IgY 9,10. Они оказались очень эффективными знаки для МРТ и исследования самостоятельно знак захвата (см обсуждения). К сожалению, IgG / IgY белки являются дорогостоящими, и поэтому не подходит для исследований знак захвата и большинство видов исследований самостоятельно знак захвата. Впоследствии, ИФА обнаружения белка второго поколения были разработаны для белков, содержащихся в куриных яиц белых (альбумин), коровье молоко (казеин) и соевого молока (ингибитор трипсина белок). Каждый анализ обладает высокой чувствительностью, конкретными, и, самоеважно, использует белки, которые значительно дешевле, чем белков IgG / Igy 11. Эти белки оказались эффективными для МРТ, марки-захвата, и исследования самостоятельно знак захвата (см обсуждения).
В этой статье мы опишем, и продемонстрировать, как проводить исследования белков Все хранения лабораторией. Такие исследования являются первым этапом исследований, необходимых для любого типа поля рассеивания исследования. В частности, важно, что следователи знают, как долго знак будут сохранены на целевых видов членистоногих, до начала разгона на поле исследований. Здесь мы опишем и продемонстрируем, как внутренне и внешне отметить насекомых для МРТ, Марк-захват, и само знак-захвата исследования типа поля. Затем мы продемонстрируем, как определить наличие отметок с косвенными и сэндвич-ИФА.
Protocol
Representative Results
Discussion
Порядок immunomarking членистоногих белок был впервые описан почти четверть века назад 9. С тех пор, эта процедура была приспособлена для изучения расселения модели широкого спектра членистоногих, использующих и внутренне и внешне управляемые IgG / IgYs. Эти белки оказались стойких маркер?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Финансирование было предоставлено USDA КРИС 5347-22620-021-00D и, в частности, по сельскому хозяйству и продовольственной исследовательская инициатива конкурентной грант №. 2011-67009-30141 от USDA Национальный институт продовольствия и сельского хозяйства. Мы благодарны за техническую поддержку Johanna Нассиф. Мы также поблагодарить Пола Бейкер, Дэвид Хортон, Диего Ньето, и Фрэнсис Sivakoff для обеспечения некоторых изображениях, используемых на рисунке 3.
Materials
| Food storage container (for insect rearing) | Rubbermaid/Tupperware | Various sizes | Various manufacturers & vendors. Mesh fabric is glued in a window ` |
| Small volume nebulizer (Micro Mist) | Teleflex-Hudson RCI | 1881 | Available online and in medical supply shops. Other brands will work as well. |
| Microcentrifuge tubes, 1.6 ml w/cap | Continental Lab Products | 4445.X | Any similar type will work. We prefer brands that have easy to open lids. |
| Styrofoam storage box for microcentrifuge tubes (5×20 grid) | RPI Corp. | 145746 | This design is nice because it doesn't crowd the tubes. |
| Dispenser, repeater | Eppendorf | 4982000322 | Anything similar will help speed up the dispensing. |
| Pestles, plastic disposable tissue grinders, 1.5 mL | Kimble Chase | 749521-1500 | Available with various vendors. Pestles can be cleaned and autoclaved for reuse. |
| BD Falcon ELISA plates, 96-well (flat bottom) | BD | 351172 | |
| Ovation pipette, manual (20-200 µl) | VistaLab | 1057-0200 or 1070-0200 | Any similar type will work. This model is ergonomic. |
| Reservoirs, sterile reagent | VistaLab | 4054-1000 | Anything similar will work. |
| Electronic pipette, 8-channel (50-1200 µl) (Biohit eLine) | Sartorius | 730391 | If you had to pick one electronic model, this size is most useful. |
| Electronic pipette, 8-channel (10-300 µl) (Biohit eLine) | Sartorius | 730361 | Anything similar will work. |
| Manifold, multiwell plate washer (8-position, straight) | Sigma-Aldrich | Z369802 | Anything similar will work for manual plate washing. |
| Microplate reader with absorbance detection | Molecular Devices | SpectraMax 250 | Anything similar will work. |
| Chicken IgG/IgY | United States Biological | I1903-15R | Also available from other sources |
| Egg whites | Grocery store | “All Whites”, “Egg Beaters”, etc. | Mix 5 mL with 95 mL dH2O for 5% solution |
| Tris (Trizma Base) | Sigma-Aldrich | T1503 | 2.42 g/L to make TBS |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | 29.22 g/L to make TBS and 8.0 g/L for PBS |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S0876 | 1.14 g/L for PBS |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | 0.2 g/L for PBS |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | 0.2 g/L for PBS |
| Tween 20, EIA grade | Sigma-Aldrich | P1379 | Add 0.5 mL per L to PBS after salts are dissolved. |
| PBS with 1% BSA | Sigma-Aldrich | P3688 | Mix 1 packet in 1 L dH20 |
| Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule) antibody produced in rabbit (1:500) | Sigma-Aldrich | C6409 | Mix 100 µl in 50 ml TBS |
| Dry Milk, Powdered or Fresh Milk (1%) | Grocery store | Mix 10 g with 1 L dH2O for 1% solution | |
| Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule)-Peroxidase antibody produced in rabbit (1:10000) | Sigma-Aldrich | A9046 | Mix 100 ul in 1 L of 1% milk |
| Anti-Chicken Egg Albumin antibody produced in rabbit (1:8000) | Sigma-Aldrich | C6534 | Dilute 125 µl in 1 L PBS-BSA |
| Goat Anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate (1:2000) | Sigma-Aldrich | A6154 | Dilute 0.5 ml in 1 L PBS-BSA, then add 1.3 ml Silwet |
| Vac-In-Stuff (Silwet L-77)silicon-polyether copolymer | Lehle Seeds | VIS-01 | Add as last ingredient |
| TMB Microwell One Component Peroxidase Substrate | SurModics | TMBW-1000-01 |
References
- Hagler, J.R., & Jackson, C.G. Methods for marking insects: Current techniques and future prospects. Annu. Rev. Entomol. 46, 511-543, (2001).
- Lavandero, B.I., Wratten, S.E., Hagler, J.R., & Jervis, M.A. The need for effective marking and tracking techniques for monitoring the movements of insect predators and parasitoids. Int. J. Pest Manage. 50 (3), 147-151, (2004).
- Hagler, J.R., Jackson, C.G., Henneberry, T.J., & Gould, J. Parasitoid mark-release-recapture techniques: II. Development and application of a protein marking technique for Eretmocerus spp., parasitoids of Bemisia argentifolii. Biocontrol Sci. Techn. 12 (6), 661-675, (2002).
- Blackmer, J.L., Hagler, J.R., Simmons, G.S., & Henneberry, T.J. Dispersal of Homalodisca vitripennis (Homoptera: Cicadellidae) from a point release site in citrus. Environ. Entomol. 35 (6), 1617-1625, (2006).
- Swezey, S.L., Nieto, D.J., Hagler, J.R., Pickett, C.H., Bryer, J.A., & Machtley, S.A. Dispersion, distribution and movement of Lygus.spp. (Hemiptera: Miridae) in trap-cropped strawberries. Environ. Entomol. 42 (4), 770-778, (2013).
- Hagler, J.R., Baker, P.B., Marchosky, R., Machtley, S.A., Bellamy, D.E. Methods to mark termites with protein for mark-release-recapture and mark-capture studies. Insect. Soc. 56 (2), 213-220, (2009).
- Baker, P.B., et al. Utilizing rabbit immunoglobulin G protein for mark-capture studies on the desert subterranean termite, Heterotermes aureus (Snyder). Insect. Soc. 57 (2), 147-155, (2010).
- Hagler, J.R., Mueller, S., Teuber, L.R., Machtley, S.A., & Van Deynze, A. Foraging range of honey bees, Apis mellifera, in alfalfa seed production fields. J. Insect Sci. 11 (1), 1-12, (2011).
- Hagler, J.R., Cohen, A.C., Bradley-Dunlop, D., & Enriquez, F.J. A new approach to mark insects for feeding and dispersal studies. Environ. Entomol. 21 (1), 20-25, (1992).
- Hagler, J.R. Field retention of a novel mark-release-recapture method. Environ. Entomol. 26 (5), 1079-1086, (1997).
- Jones, V.P., Hagler, J.R., Brunner, J., Baker, C., & Wilburn, T. An inexpensive immunomarking technique for studying movement patterns of naturally occurring insect populations. Environ. Entomol. 35 (4), 827-836, (2006).
- Sivakoff, F.S., Rosenheim, J.A., & Hagler, J.R. Threshold choice and the analysis of protein marking data in long-distance dispersal studies. Methods Ecol. Evol. 2 (1), 77-85, (2011).
- Hagler, J.R., & Jackson, C.G. An immunomarking technique for labeling minute parasitoids. Environ. Entomol. 27 (4), 1010-1016, (1998).
- Janke, J., et al. Serological marking of Pnigalio agraules (Hymenoptera: Eulophidae) for field dispersal studies. J. Pest Sci. 82 (1), 47-53, (2009).
- DeGrandi-Hoffman, G., & Hagler J.R. The flow of incoming nectar through a honey bee (Apis mellifera L.) colony as revealed by a protein marker. Insect. Soc. 47 (4), 302-306, (2000).
- Peck, S.L., & McQuate, G.T. Ecological aspects of Bactrocera latifrons (Diptera: Tephritidae) on Maui, Hawaii: Movement and host preference. Environ. Entomol. 33 (6), 1722-1731, (2004).
- Hagler, J.R., & Durand, C.M. A new method for immunologically marking prey and its use in predation studies. Entomophaga. 39 (3), 257-265, (1994).
- Hagler, J.R. An immunological approach to quantify consumption of protein-tagged Lygus hesperus by the entire cotton predator assemblage. Biol. Control. 58 (3), 337-345, (2011).
- Fournier, V., Hagler, J.R., Daane, K., de Leòn, J., & Groves, R. Identifying the predator complex of Homalodisca vitripennis (Hemiptera: Cicadellidae): A comparative study of the efficacy of an ELISA and PCR gut content assay. Oecologia. 157 (4), 629-640, (2008).
- Hagler, J.R. Development of an immunological technique for identifying multiple predator–prey interactions in a complex arthropod assemblage. Ann. Appl. Biol. 149 (2), 153-165, (2006).
- Mansfield, S., Hagler, J.R., & Whitehouse, M. A comparative study of the efficiency of a pest-specific and prey-marking ELISA for detection of predation. Entomol. Exp. Appl. 127 (3), 199-206, (2008).
- Buczkowski, G., Wang, C., & Bennett, G. Immunomarking reveals food flow and feeding relationships in the eastern subterranean termite, Reticulitermes flavipes (Kollar). Environ. Entomol. 36 (1), 173-182, (2007).
- Lundgren, J.G., Saska, P., & Honĕk, A. Molecular approach to describing a seed-based food web: The post-dispersal granivore community of an invasive plant. Ecol. Evol. 3 (6) 1642-1652, (2013).
- Kelly, J.L., Hagler, J.R., & Kaplan, I. Semiochemical lures reduce emigration and enhance pest control services in open-field augmentation. Biol. Control. 71, 70-77, (2014).
- Zilnik, G. and Hagler, J.R. An immunological approach to distinguish arthropod viviphagy from necrophagy. BioControl. 58 (6), 807-814, (2013).
- Irvin, N.A., Hagler, J.R., & Hoddle, M.S. Laboratory investigation of triple marking the parasitoid, Gonatocerus ashmeadi (Hymenoptera: Mymaridae) with a fluorescent dye and two animal proteins. Entomol. Exp. App. 143 (1), 1-12, (2011).
- Hagler, J.R., Mueller, S., Teuber, L.R., Van Deynze, A., & Martin, J. A method for distinctly marking honey bees, Apis mellifera, originating from multiple apiary locations. J. Insect Sci. 11 (143), 1-14, (2011).
- Peck, G.W., Ferguson, H.J., Jones, V.P., O'Neal, S.D., & Walsh, D.B. Use of a highly sensitive immunomarking system to characterize face fly (Diptera: Muscidae) dispersal from cow pats. Environ. Entomol. 43 (1), 116-122, (2014).
- Boina, D.R., Meyer, W.L., Onagbola, E.O., & Stelinski, L.L. Quantifying dispersal of Diaphorina citri (Hemiptera: Psyllidae) by immunomarking and potential impact of unmanaged groves on commercial citrus management. Environ. Entomol. 38 (4), 1250-1258, (2009).
- Lewis-Rosenblum, H., Tawari, X.M.S., & Stelinski, L.L. Seasonal movement patterns and long-range dispersal of Asian citrus phyllid in Florida citrus. J. Econ. Entomol. 108 (1), 3-10, (2015).
- Krugner, R., Hagler, J.R., Groves, R.L., Sisterson, M.S., Morse, J.G., & Johnson, M.W. Plant water stress effects on the net dispersal rate of the insect vector, Homalodisca vitripennis (Germar) (Hemiptera: Cicadellidae), and movement of its egg parasitoid, Gonatocerus ashmeadi Girault (Hymenoptera: Mymaridae). Environ. Entomol. 41 (6), 1279-1289, (2012).
- Klick, J., et al. Distribution and activity of Drosophila suzukii in cultivated raspberry and surrounding vegetation. J. Appl. Entomol. (2015).
- Basoalto, K., Miranda, M., Knight, A.L., & Fuentes-Contreras, E. Landscape analysis of adult codling moth (Lepidoptera: Tortricidae) distribution and dispersal within typical agroecosystems dominated by apple production in Central Chile. Environ. Entomol. 39 (5), 1399-1408, (2010).
- Horton, D.R., Jones, V.P., & Unruh, T.R. Use of a new immunomarking method to assess movement by generalist predators between a cover crop and tree canopy in a pear orchard. Amer. Entomol. 55 (1), 49-56, (2009).
- Swezey, S.L., Nieto, D.J., Pickett, C.H., Hagler, J.R., Bryer, J.A., & Machtley, S.A. Spatial density and movement of the Lygus spp. parasitoid Peristenus relictus (Hymenoptera: Braconidae) in organic strawberries with alfalfa trap crops. Environ. Entomol. 43 (2), 363-369, (2014).
- Sivakoff, F.S., Rosenheim, J.A., & Hagler, J.R. Relative dispersal ability of a key agricultural pest and its predators in an annual agroecosystem. Biol. Control. 63 (3), 296-303, (2012).
- Slosky, L. M., Hoffmann, E. J., & Hagler, J. R. A comparative study of the retention and lethality of the first and second generation arthropod protein markers. Entomol. Exp. App. 144 (2), 165-171, (2012).
- Hagler, J.R., Machtley, S.A., & Blackmer, F. A potential contamination error associated with insect protein mark-capture data. Entomol. Exp. App. 154 (1), 28-34, (2015).
- Hagler, J.R., & Jones, V.P. A protein-based approach to mark arthropods for mark-capture type research. Entomol. Exp. App. 135 (2), 177-192, (2010).
- Hagler, J.R., Naranjo, S.E., Machtley, S.A., & Blackmer, F. Development of a standardized protein immunomarking protocol for insect mark-capture dispersal research. J. Appl. Entomol. 138 (10), 772-782, (2014).
- Hagler, J.R. Variation in the efficacy of several predator gut content immunoassays. Biol. Control. 12 (1), 25-32, (1998).
- Clark, M.F., & Adams, A.N. Characteristics of microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses. J. Gen. Virol. 34 (3), 475-483, (1977).
- Crowther, J.R. The ELISA guidebook. Humana Press. Totowa, NJ, (2001).
- Stimmann, M.W. Marking insects with rubidium: Imported cabbageworm marked in the field. Environ. Entomol. 3 (2), 327-328, (1974).
