관리 및 분산 연구를위한 절지 동물에 단백질 마크를 검출
Summary
Proteins are often used to mark arthropods for dispersal research. Methods for administering internal and external protein marks on arthropods are demonstrated. Protein mark detection techniques, either through indirect or sandwich enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs), are also illustrated.
Abstract
모니터링 절지 동물의 움직임은 종종 더 나은 관련된 인구 역학, 분산 패턴, 기주 식물의 환경 설정 및 기타 생태 학적 상호 작용을 이해하는 것이 필요합니다. 절지 동물은 일반적으로 고유의 마크를 태그에 의해 자연에서 추적 한 다음 다시 수집 그들의 분산 기능을 결정하기 위해 시간과 공간을 통해들을 수 있습니다. 이러한 착색 도료 또는 먼지 등의 실제 물리적 태그 외에, 단백질의 다양한 유형에 대한 생태 학적 연구 절지 마킹하는 데 매우 효과적인 것으로 입증되었다. 단백질은 내부 및 / 또는 외부로 투여 할 수있다. 단백질이어서 특이 단백질 효소 면역 분석법 (ELISA)과 수복 절지 검출 될 수있다. 여기에서 우리는 외부와 내부에 단백질과 절지 동물에 태그를위한 프로토콜을 설명합니다. 간단한 두 실험 예는 증명되어 국소 적으로 단백질이 풍부한 규정 식 및 (2)의 외부 단백질 마크를 제공하여 곤충에게 소개 (1) 내부 단백질 마크의료용 분무기를 사용하여 곤충 pplied. 우리는 다음과 샌드위치 곤충 단백질 마크를 검출하는데 사용될 간접 ELISA 방법을 단계별로 설명 관한 것이다. 이 데모에서는, 마크 릴리스 탈환, 마크 캡처, 연구의 자기 마크 캡처 유형의 절지 동물의 수집 및 단백질 마커 검출의 다양한 측면은 immunomarking 절차가되었습니다 다양한 방법과 함께 설명되어 있습니다 연구 목적의 다양한 적합하도록.
Introduction
자연에서 절지 동물 해충, 천적 (기생 포식자), 및 수분 매개자의 움직임을 추적하는 것은 생태계 서비스를 개선하는 방법에 대한 이해에 필수적이다. 분산 연구의 대부분의 유형에 대한 핵심 요소는 관심의 절지 동물 (들) 태그를 신뢰할 수있는 방법을 가지고있다. 다양한 재료 (예를 들면, 도료, 염료, 착색 먼지, 태그, 희귀 원소, 단백질) 동작, 및 다른 생태 상호 1,2- 먹이, 그 집단의 동력학, 분산 능력을 평가하는 절지 동물을 표시하는 데 사용되어왔다.
주어진 분산 연구에 사용 마커의 적절성의 연구가 진행되고 유형에 의존 할 것이다. (1) 마크 릴리스 탈환 (MRR), (2) 마크 캡처, (3) 자기 마크 캡처 : 절지 동물을 표시하기위한 세 가지 범주화가 있습니다. 마크 릴리스 탈환 조사의 경우, 조사는 일반적으로 laborato에 집합 절지 동물을 표시RY 및 필드 중앙 지점에서 릴리스 그들을. 절지 동물은 다음 다른 수집 장치 (예를 들어, 스위프 그물, 진공, 접착 트랩) 3,4,5를 사용하여 다양한 공간과 시간 간격에서 다시 캡처됩니다. 특정 마크가 기본 개인 해제 구별 할 탈환 표본은 다음 검사합니다. 마크 캡처 연구, 연구자는 일반적으로 필드 사용하는 스프레이 장비 (예를 들어, 배낭 분무기, 붐과 노즐 스프레이)에서 직접 표를 적용한다. 마크 캡처 연구를위한 최적의 마커는 저렴하고 쉽게 절지 동물의 서식지에 적용됩니다. 자기 마크 캡처 연구, 연구자는 보통 절지 동물 미끼 6,7 또는 둥지 입구 8 마크를 적용합니다. 차례로, 절지 동물은 둥지를 빠져 나갈 때까지 마크에 대해 "칫솔질"에 의해 외부에 표시된 미끼 또는 삼키려에 의해 내부적으로 자체를 표시합니다.
위에서 언급 한 바와 같이, 마커의 많은 유형이 우리를왔다ED는 절지 동물 종의 다양한 태그를. 그러나 거의 이러한 분산 연구 범주의 세 가지 유용하다. 단백질 immunomarking 절차의 개발은 곤충 마킹 돌파구이었다. Immunomarking은 절지 동물에 단백질 라벨을두고 내부적 또는 외부 적으로, 이는 차례로, 항 – 단백질 특정 효소 면역 분석법 (ELISA)에 의해 검출된다. 사용 된 최초의 단백질 마커는 토끼 면역 글로불린 (IgG를) 닭의 IgG / IGY 9,10했다. 그들은 MRR과 자기 마크 캡처 연구 (설명 참조)에 매우 효과적 마크 입증했다. 불행하게도, IgG의 / IGY 단백질은 비용이 많이 드는 때문에 마크 캡처 연구 및 자체 마크 캡처 연구의 대부분의 유형에 대한 실질적인 없습니다. 그 후, 2 세대 단백질 검출 ELISA를 닭 달걀 흰자 (알부민), 우유 (카제인)과 두유 (트립신 억제제 단백질)에 포함 된 단백질을 위해 개발되었다. 각각의 분석은, 매우 민감한 특정, 가장중요한 것은, 훨씬 적은 비용의 IgG / IGY 단백질 (11)보다 단백질을 사용합니다. 이 단백질은 MRR, 마크 캡처, 자기 마크 캡처 연구 (토론 참조)에 대한 효과가 입증하고있다.
이 글에서, 우리는 기술과 단백질 마크 실험실 보존 연구를 수행하는 방법을 보여줍니다. 이러한 연구는 전계 분산 연구의 모든 유형에 필요한 조사의 첫 단계이다. 연구자가 표시 전에 필드 분산 연구에 착수을 대상 절지 동물 종에 유지됩니다 얼마나 알고 구체적으로는 중요하다. 여기, 우리가 설명하고 내부 및 외부 MRR 곤충, 마크 캡처, 자기 마크 캡처 형 현장 연구를 표시하는 방법을 보여줍니다. 우리는 간접적 샌드위치 ELISA를 함께 표시의 존재를 검출하는 방법을 보여줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
절지 동물 단백질 immunomarking 절차는 먼저 세기 전 (9)의 4 분의 1 정도를 설명했다. 이후 절차는 내부 및 외부 투여의 IgG / IgYs를 사용 절지 동물의 다양한 분산 패턴을 연구하기 위해 적용되어왔다. 이 단백질은 지금까지 테스트 곤충 종의 다양한에 대한 확고한 마커를 입증했다. 그러나, 전술 한 바와 같이, IgG의 / IgYs를 사용하는 주요 한계는 이들이 매우 비싸다는 것이다. 따라서, IgG의 / IgY…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
자금은 농업 및 식품 연구 이니셔티브 경쟁 그랜트 아니에 의해, 부분적으로, USDA CRIS 5347-22620-021-00D에 의해 제공되었다. 식량 농업의 USDA 국립 연구소에서 2011-67009-30141. 우리는 요한나 Nassif의 기술 지원을 감사하고 있습니다. 우리는 또한 그림 3에서 사용 된 사진의 일부를 제공하기 위해 폴 베이커, 데이비드 호튼, 디에고 니에 토와 프랜시스 Sivakoff 감사합니다.
Materials
| Food storage container (for insect rearing) | Rubbermaid/Tupperware | Various sizes | Various manufacturers & vendors. Mesh fabric is glued in a window ` |
| Small volume nebulizer (Micro Mist) | Teleflex-Hudson RCI | 1881 | Available online and in medical supply shops. Other brands will work as well. |
| Microcentrifuge tubes, 1.6 ml w/cap | Continental Lab Products | 4445.X | Any similar type will work. We prefer brands that have easy to open lids. |
| Styrofoam storage box for microcentrifuge tubes (5×20 grid) | RPI Corp. | 145746 | This design is nice because it doesn't crowd the tubes. |
| Dispenser, repeater | Eppendorf | 4982000322 | Anything similar will help speed up the dispensing. |
| Pestles, plastic disposable tissue grinders, 1.5 mL | Kimble Chase | 749521-1500 | Available with various vendors. Pestles can be cleaned and autoclaved for reuse. |
| BD Falcon ELISA plates, 96-well (flat bottom) | BD | 351172 | |
| Ovation pipette, manual (20-200 µl) | VistaLab | 1057-0200 or 1070-0200 | Any similar type will work. This model is ergonomic. |
| Reservoirs, sterile reagent | VistaLab | 4054-1000 | Anything similar will work. |
| Electronic pipette, 8-channel (50-1200 µl) (Biohit eLine) | Sartorius | 730391 | If you had to pick one electronic model, this size is most useful. |
| Electronic pipette, 8-channel (10-300 µl) (Biohit eLine) | Sartorius | 730361 | Anything similar will work. |
| Manifold, multiwell plate washer (8-position, straight) | Sigma-Aldrich | Z369802 | Anything similar will work for manual plate washing. |
| Microplate reader with absorbance detection | Molecular Devices | SpectraMax 250 | Anything similar will work. |
| Chicken IgG/IgY | United States Biological | I1903-15R | Also available from other sources |
| Egg whites | Grocery store | “All Whites”, “Egg Beaters”, etc. | Mix 5 mL with 95 mL dH2O for 5% solution |
| Tris (Trizma Base) | Sigma-Aldrich | T1503 | 2.42 g/L to make TBS |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | 29.22 g/L to make TBS and 8.0 g/L for PBS |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S0876 | 1.14 g/L for PBS |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | 0.2 g/L for PBS |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | 0.2 g/L for PBS |
| Tween 20, EIA grade | Sigma-Aldrich | P1379 | Add 0.5 mL per L to PBS after salts are dissolved. |
| PBS with 1% BSA | Sigma-Aldrich | P3688 | Mix 1 packet in 1 L dH20 |
| Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule) antibody produced in rabbit (1:500) | Sigma-Aldrich | C6409 | Mix 100 µl in 50 ml TBS |
| Dry Milk, Powdered or Fresh Milk (1%) | Grocery store | Mix 10 g with 1 L dH2O for 1% solution | |
| Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule)-Peroxidase antibody produced in rabbit (1:10000) | Sigma-Aldrich | A9046 | Mix 100 ul in 1 L of 1% milk |
| Anti-Chicken Egg Albumin antibody produced in rabbit (1:8000) | Sigma-Aldrich | C6534 | Dilute 125 µl in 1 L PBS-BSA |
| Goat Anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate (1:2000) | Sigma-Aldrich | A6154 | Dilute 0.5 ml in 1 L PBS-BSA, then add 1.3 ml Silwet |
| Vac-In-Stuff (Silwet L-77)silicon-polyether copolymer | Lehle Seeds | VIS-01 | Add as last ingredient |
| TMB Microwell One Component Peroxidase Substrate | SurModics | TMBW-1000-01 |
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