Proteins are often used to mark arthropods for dispersal research. Methods for administering internal and external protein marks on arthropods are demonstrated. Protein mark detection techniques, either through indirect or sandwich enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs), are also illustrated.
निगरानी सन्धिपाद आंदोलन अक्सर बेहतर जुड़े जनसंख्या गतिशीलता, प्रसार पैटर्न, मेजबान संयंत्र प्राथमिकताएं, और अन्य पारिस्थितिक बातचीत को समझने के लिए आवश्यक है। Arthropods आमतौर पर एक अनूठी छाप के साथ उन्हें टैगिंग द्वारा प्रकृति में लगाया और फिर पुन: एकत्रित उनके प्रसार क्षमताओं का निर्धारण करने के लिए समय और स्थान पर उन्हें कर रहे हैं। इस तरह के रंगीन धूल या रंग के रूप में वास्तविक भौतिक टैग, के अलावा, प्रोटीन के विभिन्न प्रकार के पारिस्थितिक अनुसंधान के लिए arthropods अंकन के लिए बहुत कारगर साबित किया है। प्रोटीन आंतरिक और / या बाह्य रूप से प्रशासित किया जा सकता है। प्रोटीन तो एक प्रोटीन विशेष एंजाइम से जुड़ी immunosorbent परख (एलिसा) के साथ पुनः कब्जा arthropods पर पता लगाया जा सकता है। यहाँ हम बाह्य और आंतरिक प्रोटीन के साथ arthropods टैगिंग के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन है। दो सरल प्रयोगात्मक उदाहरण प्रदर्शन कर रहे हैं: topically एक एक प्रोटीन समृद्ध आहार और (2) एक बाहरी प्रोटीन निशान प्रदान करके एक कीट के लिए शुरू की (1) एक आंतरिक प्रोटीन निशानएक मेडिकल छिटकानेवाला का उपयोग कर एक कीट को pplied। हम तो सैंडविच और कीड़ों पर प्रोटीन के निशान का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया अप्रत्यक्ष एलिसा तरीकों में से एक कदम-दर-कदम गाइड से संबंधित हैं। इस प्रदर्शन में, मार्क-रिहाई-पीछे हटा, मार्क-कब्जा, और अनुसंधान के आत्म-मार्क-कब्जा प्रकार के लिए arthropods पर अधिग्रहण और प्रोटीन मार्कर का पता लगाने के विभिन्न पहलुओं immunomarking प्रक्रिया किया गया है कि विभिन्न तरीकों के साथ-साथ चर्चा कर रहे हैं अनुसंधान उद्देश्यों की एक विस्तृत विविधता के अनुरूप रूपांतरित किया।
प्रकृति में सन्धिपाद कीट, प्राकृतिक दुश्मन (parasitoids और शिकारियों), और परागण की आवाजाही पर नज़र रखने के पारिस्थितिकी तंत्र सेवाओं में सुधार करने के लिए कैसे बेहतर समझ के लिए आवश्यक है। प्रसार अनुसंधान के सबसे प्रकार के लिए प्रमुख घटक ब्याज की सन्धिपाद (एस) टैग करने के लिए एक विश्वसनीय तरीका हो रही है। सामग्री की एक किस्म (जैसे, पेंट, रंग, रंग धूल, टैग, दुर्लभ तत्व, प्रोटीन) व्यवहार, और अन्य पारिस्थितिक बातचीत 1,2 खिला, उनकी जनसंख्या गतिशीलता, प्रसार क्षमताओं का आकलन करने के लिए arthropods चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है।
किसी भी प्रसार अनुसंधान के लिए इस्तेमाल एक मार्कर के औचित्य अध्ययन के प्रकार का आयोजन किया जा रहा है पर निर्भर हो जाएगा। (1) मार्क-रिहाई-पीछे हटाना (एमआरआर), (2) मार्क-कब्जा, और (3) आत्म-मार्क-कब्जा: arthropods अंकन के लिए मोटे तौर पर तीन वर्गीकरण कर रहे हैं। मार्क-रिहाई-पीछे हटा अनुसंधान के लिए, अन्वेषक आम तौर पर laborato में सामूहिक arthropods के निशानry और क्षेत्र में एक केंद्रीय बिंदु पर विज्ञप्ति उन्हें। arthropods तो अलग संग्रह उपकरणों (जैसे, झाडू शुद्ध, निर्वात, चिपचिपा जाल) 3,4,5 का उपयोग कर विभिन्न स्थानिक और लौकिक अंतराल पर पुनः कब्जा कर रहे हैं। विशिष्ट निशान मूल निवासी व्यक्तियों से रिहा भेद करने के लिए पुनः कब्जा नमूनों तो जांच कर रहे हैं। मार्क-कब्जा अनुसंधान के लिए, अन्वेषक आमतौर पर क्षेत्र का उपयोग स्प्रे उपकरण (जैसे, बैग स्प्रेयर, उछाल और नोक स्प्रेयर) में सीधे निशान लागू होता है। मार्क-कब्जा अनुसंधान के लिए सबसे अच्छा मार्कर सस्ती और आसानी से सन्धिपाद के निवास स्थान के लिए लागू होते हैं। आत्म-निशान पर कब्जा अनुसंधान के लिए, अन्वेषक आमतौर पर एक सन्धिपाद चारा 6.7 या घोंसला प्रवेश द्वार से 8 के निशान लागू होता है। बदले में, सन्धिपाद यह घोंसला बाहर निकलता है के रूप में मार्क के खिलाफ "brushing" द्वारा बाह्य उल्लेखनीय चारा या भक्षण द्वारा आंतरिक रूप से खुद को चिह्नित करता है।
जैसा कि ऊपर कहा, मार्कर के कई प्रकार हमें दिया गया हैएड सन्धिपाद प्रजाति की एक किस्म टैग करने के लिए। हालांकि, बहुत कुछ इन प्रसार अनुसंधान श्रेणियों के सभी तीन के लिए उपयोगी होते हैं। प्रोटीन immunomarking प्रक्रिया के विकास के कीड़ों को चिह्नित करने के लिए एक बड़ी सफलता थी। Immunomarking arthropods पर एक प्रोटीन लेबल डालता है या तो आंतरिक या बाह्य जो, बारी में, एक विरोधी प्रोटीन विशेष एंजाइम से जुड़ी immunosorbent परख (एलिसा) द्वारा पता चला है। इस्तेमाल पहली ऐसी प्रोटीन मार्कर खरगोश इम्युनोग्लोबुलिन (आईजीजी) और चिकन आईजीजी / IgY 9,10 थे। वे एमआरआर और आत्म-निशान पर कब्जा अनुसंधान (चर्चा देखें) के लिए बहुत प्रभावी निशान साबित हुई। दुर्भाग्य से, आईजीजी / IgY प्रोटीन महंगा कर रहे हैं और इसलिए निशान पर कब्जा अनुसंधान और आत्म-निशान पर कब्जा अनुसंधान के सबसे प्रकार के लिए व्यावहारिक नहीं हैं। इसके बाद दूसरी पीढ़ी के प्रोटीन का पता लगाने ELISAs चिकन अंडे का सफेद (एल्बुमिन), गाय के दूध (कैसिइन) और सोया दूध (trypsin अवरोध प्रोटीन) में निहित प्रोटीन के लिए विकसित किए गए। प्रत्येक परख, अत्यधिक संवेदनशील विशिष्ट है, और सबसे अधिकमहत्वपूर्ण बात है, बहुत कम खर्चीला आईजीजी / IgY प्रोटीन 11 से कर रहे हैं कि प्रोटीन का उपयोग करता है। ये प्रोटीन एमआरआर, मार्क कब्जा है, और आत्म-निशान पर कब्जा अनुसंधान (चर्चा देखें) के लिए प्रभावी सिद्ध कर दिया है।
इस अनुच्छेद में, हम का वर्णन है और प्रोटीन निशान प्रयोगशाला प्रतिधारण अध्ययन का संचालन करने के लिए कैसे प्रदर्शित करता है। इस तरह के अध्ययन क्षेत्र प्रसार अध्ययन के किसी भी प्रकार के लिए आवश्यक अनुसंधान के पहले चरण में हैं। जांचकर्ताओं के निशान से पहले क्षेत्र प्रसार के अध्ययन पर तैयार करने का लक्ष्य रखा सन्धिपाद प्रजातियों पर बनाए रखा जाएगा कि कितनी देर तक पता है कि विशेष रूप से, यह महत्वपूर्ण है। यहाँ, हम का वर्णन है और आंतरिक और बाह्य एमआरआर के लिए कीड़े, मार्क-कब्जा, और आत्म-मार्क-कब्जा प्रकार के अध्ययन के क्षेत्र चिह्नित करने के लिए कैसे प्रदर्शित करता है। हम तो अप्रत्यक्ष और सैंडविच ELISAs साथ निशान की उपस्थिति का पता लगाने के लिए कैसे प्रदर्शित करता है।
सन्धिपाद प्रोटीन immunomarking प्रक्रिया पहले एक सदी पहले 9 के लगभग एक चौथाई वर्णित किया गया था। तब से, प्रक्रिया दोनों आंतरिक और बाह्य प्रशासित आईजीजी / IgYs का उपयोग कर arthropods की एक विस्तृत विविधता का प्रसार पै?…
The authors have nothing to disclose.
अनुदान के कृषि और खाद्य अनुसंधान पहल प्रतिस्पर्धी अनुदान कोई द्वारा, भाग में, यूएसडीए क्रिस 5347-22620-021-00D द्वारा प्रदान किया गया था। खाद्य और कृषि के यूएसडीए नेशनल इंस्टीट्यूट से 2011-67009-30141। हम जोहन्ना Nassif के तकनीकी समर्थन के लिए आभारी हैं। हम यह भी चित्रा 3 में उपयोग किए गए चित्रों में से कुछ को उपलब्ध कराने के लिए पॉल बेकर, डेविड होर्टन, डिएगो Nieto, और फ्रांसिस Sivakoff धन्यवाद।
Food storage container (for insect rearing) | Rubbermaid/Tupperware | Various sizes | Various manufacturers & vendors. Mesh fabric is glued in a window ` |
Small volume nebulizer (Micro Mist) | Teleflex-Hudson RCI | 1881 | Available online and in medical supply shops. Other brands will work as well. |
Microcentrifuge tubes, 1.6 ml w/cap | Continental Lab Products | 4445.X | Any similar type will work. We prefer brands that have easy to open lids. |
Styrofoam storage box for microcentrifuge tubes (5×20 grid) | RPI Corp. | 145746 | This design is nice because it doesn't crowd the tubes. |
Dispenser, repeater | Eppendorf | 4982000322 | Anything similar will help speed up the dispensing. |
Pestles, plastic disposable tissue grinders, 1.5 mL | Kimble Chase | 749521-1500 | Available with various vendors. Pestles can be cleaned and autoclaved for reuse. |
BD Falcon ELISA plates, 96-well (flat bottom) | BD | 351172 | |
Ovation pipette, manual (20-200 µl) | VistaLab | 1057-0200 or 1070-0200 | Any similar type will work. This model is ergonomic. |
Reservoirs, sterile reagent | VistaLab | 4054-1000 | Anything similar will work. |
Electronic pipette, 8-channel (50-1200 µl) (Biohit eLine) | Sartorius | 730391 | If you had to pick one electronic model, this size is most useful. |
Electronic pipette, 8-channel (10-300 µl) (Biohit eLine) | Sartorius | 730361 | Anything similar will work. |
Manifold, multiwell plate washer (8-position, straight) | Sigma-Aldrich | Z369802 | Anything similar will work for manual plate washing. |
Microplate reader with absorbance detection | Molecular Devices | SpectraMax 250 | Anything similar will work. |
Chicken IgG/IgY | United States Biological | I1903-15R | Also available from other sources |
Egg whites | Grocery store | “All Whites”, “Egg Beaters”, etc. | Mix 5 mL with 95 mL dH2O for 5% solution |
Tris (Trizma Base) | Sigma-Aldrich | T1503 | 2.42 g/L to make TBS |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | 29.22 g/L to make TBS and 8.0 g/L for PBS |
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S0876 | 1.14 g/L for PBS |
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | 0.2 g/L for PBS |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | 0.2 g/L for PBS |
Tween 20, EIA grade | Sigma-Aldrich | P1379 | Add 0.5 mL per L to PBS after salts are dissolved. |
PBS with 1% BSA | Sigma-Aldrich | P3688 | Mix 1 packet in 1 L dH20 |
Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule) antibody produced in rabbit (1:500) | Sigma-Aldrich | C6409 | Mix 100 µl in 50 ml TBS |
Dry Milk, Powdered or Fresh Milk (1%) | Grocery store | Mix 10 g with 1 L dH2O for 1% solution | |
Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule)-Peroxidase antibody produced in rabbit (1:10000) | Sigma-Aldrich | A9046 | Mix 100 ul in 1 L of 1% milk |
Anti-Chicken Egg Albumin antibody produced in rabbit (1:8000) | Sigma-Aldrich | C6534 | Dilute 125 µl in 1 L PBS-BSA |
Goat Anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate (1:2000) | Sigma-Aldrich | A6154 | Dilute 0.5 ml in 1 L PBS-BSA, then add 1.3 ml Silwet |
Vac-In-Stuff (Silwet L-77)silicon-polyether copolymer | Lehle Seeds | VIS-01 | Add as last ingredient |
TMB Microwell One Component Peroxidase Substrate | SurModics | TMBW-1000-01 |