ניהול וזיהוי סימני חלבון על פרוקי רגליים לחקר פיזור
Summary
Proteins are often used to mark arthropods for dispersal research. Methods for administering internal and external protein marks on arthropods are demonstrated. Protein mark detection techniques, either through indirect or sandwich enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs), are also illustrated.
Abstract
תנועת פרוקי רגלי ניטור נדרשה לעתים קרובות כדי להבין טוב יותר את הדינמיקה הקשורים האוכלוסייה, דפוסי פיזור, העדפות צמח מארח, ואינטראקציות אקולוגיות אחרות. פרוקי רגליים בדרך כלל במעקב בטבע על ידי תיוגם עם סימן ייחודי ולאחר מכן לאורך זמן ובמרחבם כדי לקבוע את יכולות פיזורם באיסוף מחדש. בנוסף לתגים פיזיים ממשיים, כגון אבק או צבע צבעוניים, סוגים שונים של חלבונים הוכחו כיעילות מאוד לסימון פרוקי רגליים למחקר אקולוגי. יכולים להינתן חלבונים פנימיים ו / או חיצוני. אז יכולים להיות שזוהו החלבונים על פרוקי רגליים וכבשו עם assay חלבון ספציפי צמוד אנזים immunosorbent (ELISA). כאן אנו מתארים פרוטוקולים לחוץ וכלפי פן תיוג פרוקי רגליים עם חלבון. שתי דוגמאות ניסיוניות פשוטות הם הפגינו: (1) סימן חלבון פנימי הציג לחרקים על ידי מתן תזונה מועשר בחלבון ו- (2) סימן חלבון חיצוני topicallypplied לחרקים באמצעות nebulizer רפואי. לאחר מכן, אנו מתייחסים מדריך צעד-אחר-צעד של הכריך ושיטות ELISA עקיפים משמשות לאיתור סימני חלבון בחרקים. בהפגנה זו, היבטים שונים של הרכישה והגילוי של סמני חלבון על פרוקי רגליים לסימן-שחרור-לכבוש מחדש, סימן-ללכוד, וסוגים-סימן-לכידה העצמית של מחקר הם דנו, יחד עם הדרכים השונות כי הליך immunomarking היה מותאם כך שיתאים למגוון רחב של מטרות מחקר.
Introduction
מעקב התנועה של מזיקי פרוקי רגליים, אויבים טבעיים (טפילים וטורפים), ומאביקים בטבע הוא חיוני להבנה טובה יותר כיצד לשפר את שירותי מערכת אקולוגית. המרכיב המרכזי במרבית הסוגים של מחקר הוא שיש פיזור שיטה אמינה כדי לתייג את פרוקי הרגליים (ים) של עניין. מגוון רחב של חומרים (לדוגמא, צבעים, צבעים, אבקות צבעוניות, תגים, אלמנטים נדירים, חלבונים) שימשו כדי לסמן פרוקי רגליים להעריך דינמיקת האוכלוסייה שלהם, יכולות פיזור, האכלת התנהגויות, ואינטראקציות אקולוגיות אחרות 1,2.
נאותות סמן המשמש לכל מחקר פיזור נתון תהיה תלויים בסוג של מחקר שנערך. ישנם שלושה סיווגים רחבים לסימון פרוקי רגליים: (1) סימן-שחרור-לכבוש מחדש (MRR), (2) סימן-ללכוד, ו- (3) סימן-לכידה עצמית. למחקר סימן-שחרור-לכבוש מחדש, החוקר בדרך כלל מסמן את פרוקי הרגליים קולקטיבי בlaboratoר"י ומשחרר אותם בנקודה מרכזית בתחום. אז פרוקי רגליהם כבשו במרווחי מרחב ובזמן שונים באמצעות מכשירי אוסף שונים (בניכוי למשל, לטאטא, ואקום, מלכודת דביקה) 3,4,5. אז הדגימות כבשו נבחנות לסימן הספציפי להבחין שוחררו מאנשים מקומיים. למחקר סימן-ללכוד, החוקר בדרך כלל חל הסימן ישירות בציוד השדה באמצעות תרסיס (למשל, מרסס תרמיל, בום ומרסס זרבובית). הסמנים הטובים ביותר עבור מחקר סימן-לכידה זולים ובקלות להחיל בית הגידול של פרוקי הרגליים. למחקר-סימן-לכידה עצמית, החוקר בדרך כלל חל סימנים לכניסה פיתיון פרוקי רגליים 6,7 או 8 קן. בתורו, פרוקי הרגליים מסמנת את עצמו באופן פנימי על ידי טורף את הפיתיון המסומן או חיצוני על ידי "צחצוח" נגד סימן יציאתו לקן.
כפי שצוין לעיל, סוגים רבים של סמנים היואד לתייג מגוון מיני פרוקי רגליים. עם זאת, מעט מאוד שימושיים לכל שלושת קטגוריות מחקר פיזור אלה. הפיתוח של הליך immunomarking החלבון היה פריצת דרך משמעותית עבור סימון חרקים. Immunomarking מעמיד תווית חלבון על פרוקי רגליים פנימיים או חיצוני אשר, בתורו, הוא זוהה על ידי assay נגד חלבון מסוים צמוד אנזים immunosorbent (ELISA). סמני החלבון הראשונים מסוג המשמשים היו אימונוגלובולינים ארנב (IgG) וIgG עוף / IgY 9,10. הם הוכיחו להיות יעילים מאוד סימנים לMRR ומחקר-סימן-לכידה עצמית (ראה דיון). למרבה הצער, חלבוני IgG / IgY הם יקרים ולכן אינם מעשיים למחקר סימן-לכידה ורוב הסוגים של מחקר-סימן-לכידה עצמית. בהמשך לכך, ELISAs זיהוי חלבון הדור השני פותחו עבור חלבונים כלולים בחלבוני ביצת עוף (אלבומין), חלב פרה (קזאין) וחלב סויה (חלבון מעכב טריפסין). כל assay הוא רגיש מאוד, ספציפי, והכיחשוב מכך, משתמש בחלבונים שהם הרבה פחות יקרים מאשר חלבוני IgG / IgY 11. חלבונים אלה הוכחו כיעילים לMRR, סימן-ללכוד, ומחקר-סימן-לכידה עצמית (ראה דיון).
במאמר זה, אנו מתארים ומדגימים כיצד לבצע מחקרי שימור המעבדה סימן חלבון. מחקרים כאלה הם השלב הראשון של המחקר הדרוש לכל סוג של מחקר פיזור שדה. באופן ספציפי, זה קריטי, כי חוקרים יודעים כמה זמן הסימן יישמר על מיני פרוקי רגליים הממוקדים לפני היציאה ללימודי פיזור שדה. כאן אנו מתארים ומדגימים כיצד פנימיים והן חיצוניים כדי לסמן חרקים לMRR, סימן-ללכוד, ומחקרי שדה הסוג-סימן-לכידה עצמית. לאחר מכן, אנו מדגימים כיצד לזהות הנוכחות של הסימנים עם ELISAs העקיף וכריך.
Protocol
Representative Results
Discussion
הליך immunomarking חלבון פרוקי רגליים תואר לראשונה כמעט רבע מאה לפני 9. מאז, ההליך הותאם ללמוד את דפוסי הפיזור של מגוון רחב של פרוקי רגליים באמצעות IgG / IgYs מנוהל פנימי וחיצוני. חלבונים אלה הוכיחו סמנים איתנים למגוון הרחב של מיני חרקים נבדקו עד כה. עם זאת, כאמור לעיל, המגב?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מימון ניתן על ידי משרד החקלאות האמריקאי כריס 5347-22620-021-00D ו, בחלקו, על ידי החקלאות ומזון מענק המחקר תחרותי היוזמה לא. 2011-67009-30141 מהמכון הלאומי USDA של מזון וחקלאות. אנחנו אסירי תודה על התמיכה הטכנית של יוהנה Nassif. אנו מודים גם פול בייקר, דוד הורטון, דייגו Nieto, ופרנסס Sivakoff למתן חלק מהתמונות השתמשו באיור 3.
Materials
| Food storage container (for insect rearing) | Rubbermaid/Tupperware | Various sizes | Various manufacturers & vendors. Mesh fabric is glued in a window ` |
| Small volume nebulizer (Micro Mist) | Teleflex-Hudson RCI | 1881 | Available online and in medical supply shops. Other brands will work as well. |
| Microcentrifuge tubes, 1.6 ml w/cap | Continental Lab Products | 4445.X | Any similar type will work. We prefer brands that have easy to open lids. |
| Styrofoam storage box for microcentrifuge tubes (5×20 grid) | RPI Corp. | 145746 | This design is nice because it doesn't crowd the tubes. |
| Dispenser, repeater | Eppendorf | 4982000322 | Anything similar will help speed up the dispensing. |
| Pestles, plastic disposable tissue grinders, 1.5 mL | Kimble Chase | 749521-1500 | Available with various vendors. Pestles can be cleaned and autoclaved for reuse. |
| BD Falcon ELISA plates, 96-well (flat bottom) | BD | 351172 | |
| Ovation pipette, manual (20-200 µl) | VistaLab | 1057-0200 or 1070-0200 | Any similar type will work. This model is ergonomic. |
| Reservoirs, sterile reagent | VistaLab | 4054-1000 | Anything similar will work. |
| Electronic pipette, 8-channel (50-1200 µl) (Biohit eLine) | Sartorius | 730391 | If you had to pick one electronic model, this size is most useful. |
| Electronic pipette, 8-channel (10-300 µl) (Biohit eLine) | Sartorius | 730361 | Anything similar will work. |
| Manifold, multiwell plate washer (8-position, straight) | Sigma-Aldrich | Z369802 | Anything similar will work for manual plate washing. |
| Microplate reader with absorbance detection | Molecular Devices | SpectraMax 250 | Anything similar will work. |
| Chicken IgG/IgY | United States Biological | I1903-15R | Also available from other sources |
| Egg whites | Grocery store | “All Whites”, “Egg Beaters”, etc. | Mix 5 mL with 95 mL dH2O for 5% solution |
| Tris (Trizma Base) | Sigma-Aldrich | T1503 | 2.42 g/L to make TBS |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | 29.22 g/L to make TBS and 8.0 g/L for PBS |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S0876 | 1.14 g/L for PBS |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | 0.2 g/L for PBS |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | 0.2 g/L for PBS |
| Tween 20, EIA grade | Sigma-Aldrich | P1379 | Add 0.5 mL per L to PBS after salts are dissolved. |
| PBS with 1% BSA | Sigma-Aldrich | P3688 | Mix 1 packet in 1 L dH20 |
| Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule) antibody produced in rabbit (1:500) | Sigma-Aldrich | C6409 | Mix 100 µl in 50 ml TBS |
| Dry Milk, Powdered or Fresh Milk (1%) | Grocery store | Mix 10 g with 1 L dH2O for 1% solution | |
| Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule)-Peroxidase antibody produced in rabbit (1:10000) | Sigma-Aldrich | A9046 | Mix 100 ul in 1 L of 1% milk |
| Anti-Chicken Egg Albumin antibody produced in rabbit (1:8000) | Sigma-Aldrich | C6534 | Dilute 125 µl in 1 L PBS-BSA |
| Goat Anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate (1:2000) | Sigma-Aldrich | A6154 | Dilute 0.5 ml in 1 L PBS-BSA, then add 1.3 ml Silwet |
| Vac-In-Stuff (Silwet L-77)silicon-polyether copolymer | Lehle Seeds | VIS-01 | Add as last ingredient |
| TMB Microwell One Component Peroxidase Substrate | SurModics | TMBW-1000-01 |
References
- Hagler, J.R., & Jackson, C.G. Methods for marking insects: Current techniques and future prospects. Annu. Rev. Entomol. 46, 511-543, (2001).
- Lavandero, B.I., Wratten, S.E., Hagler, J.R., & Jervis, M.A. The need for effective marking and tracking techniques for monitoring the movements of insect predators and parasitoids. Int. J. Pest Manage. 50 (3), 147-151, (2004).
- Hagler, J.R., Jackson, C.G., Henneberry, T.J., & Gould, J. Parasitoid mark-release-recapture techniques: II. Development and application of a protein marking technique for Eretmocerus spp., parasitoids of Bemisia argentifolii. Biocontrol Sci. Techn. 12 (6), 661-675, (2002).
- Blackmer, J.L., Hagler, J.R., Simmons, G.S., & Henneberry, T.J. Dispersal of Homalodisca vitripennis (Homoptera: Cicadellidae) from a point release site in citrus. Environ. Entomol. 35 (6), 1617-1625, (2006).
- Swezey, S.L., Nieto, D.J., Hagler, J.R., Pickett, C.H., Bryer, J.A., & Machtley, S.A. Dispersion, distribution and movement of Lygus.spp. (Hemiptera: Miridae) in trap-cropped strawberries. Environ. Entomol. 42 (4), 770-778, (2013).
- Hagler, J.R., Baker, P.B., Marchosky, R., Machtley, S.A., Bellamy, D.E. Methods to mark termites with protein for mark-release-recapture and mark-capture studies. Insect. Soc. 56 (2), 213-220, (2009).
- Baker, P.B., et al. Utilizing rabbit immunoglobulin G protein for mark-capture studies on the desert subterranean termite, Heterotermes aureus (Snyder). Insect. Soc. 57 (2), 147-155, (2010).
- Hagler, J.R., Mueller, S., Teuber, L.R., Machtley, S.A., & Van Deynze, A. Foraging range of honey bees, Apis mellifera, in alfalfa seed production fields. J. Insect Sci. 11 (1), 1-12, (2011).
- Hagler, J.R., Cohen, A.C., Bradley-Dunlop, D., & Enriquez, F.J. A new approach to mark insects for feeding and dispersal studies. Environ. Entomol. 21 (1), 20-25, (1992).
- Hagler, J.R. Field retention of a novel mark-release-recapture method. Environ. Entomol. 26 (5), 1079-1086, (1997).
- Jones, V.P., Hagler, J.R., Brunner, J., Baker, C., & Wilburn, T. An inexpensive immunomarking technique for studying movement patterns of naturally occurring insect populations. Environ. Entomol. 35 (4), 827-836, (2006).
- Sivakoff, F.S., Rosenheim, J.A., & Hagler, J.R. Threshold choice and the analysis of protein marking data in long-distance dispersal studies. Methods Ecol. Evol. 2 (1), 77-85, (2011).
- Hagler, J.R., & Jackson, C.G. An immunomarking technique for labeling minute parasitoids. Environ. Entomol. 27 (4), 1010-1016, (1998).
- Janke, J., et al. Serological marking of Pnigalio agraules (Hymenoptera: Eulophidae) for field dispersal studies. J. Pest Sci. 82 (1), 47-53, (2009).
- DeGrandi-Hoffman, G., & Hagler J.R. The flow of incoming nectar through a honey bee (Apis mellifera L.) colony as revealed by a protein marker. Insect. Soc. 47 (4), 302-306, (2000).
- Peck, S.L., & McQuate, G.T. Ecological aspects of Bactrocera latifrons (Diptera: Tephritidae) on Maui, Hawaii: Movement and host preference. Environ. Entomol. 33 (6), 1722-1731, (2004).
- Hagler, J.R., & Durand, C.M. A new method for immunologically marking prey and its use in predation studies. Entomophaga. 39 (3), 257-265, (1994).
- Hagler, J.R. An immunological approach to quantify consumption of protein-tagged Lygus hesperus by the entire cotton predator assemblage. Biol. Control. 58 (3), 337-345, (2011).
- Fournier, V., Hagler, J.R., Daane, K., de Leòn, J., & Groves, R. Identifying the predator complex of Homalodisca vitripennis (Hemiptera: Cicadellidae): A comparative study of the efficacy of an ELISA and PCR gut content assay. Oecologia. 157 (4), 629-640, (2008).
- Hagler, J.R. Development of an immunological technique for identifying multiple predator–prey interactions in a complex arthropod assemblage. Ann. Appl. Biol. 149 (2), 153-165, (2006).
- Mansfield, S., Hagler, J.R., & Whitehouse, M. A comparative study of the efficiency of a pest-specific and prey-marking ELISA for detection of predation. Entomol. Exp. Appl. 127 (3), 199-206, (2008).
- Buczkowski, G., Wang, C., & Bennett, G. Immunomarking reveals food flow and feeding relationships in the eastern subterranean termite, Reticulitermes flavipes (Kollar). Environ. Entomol. 36 (1), 173-182, (2007).
- Lundgren, J.G., Saska, P., & Honĕk, A. Molecular approach to describing a seed-based food web: The post-dispersal granivore community of an invasive plant. Ecol. Evol. 3 (6) 1642-1652, (2013).
- Kelly, J.L., Hagler, J.R., & Kaplan, I. Semiochemical lures reduce emigration and enhance pest control services in open-field augmentation. Biol. Control. 71, 70-77, (2014).
- Zilnik, G. and Hagler, J.R. An immunological approach to distinguish arthropod viviphagy from necrophagy. BioControl. 58 (6), 807-814, (2013).
- Irvin, N.A., Hagler, J.R., & Hoddle, M.S. Laboratory investigation of triple marking the parasitoid, Gonatocerus ashmeadi (Hymenoptera: Mymaridae) with a fluorescent dye and two animal proteins. Entomol. Exp. App. 143 (1), 1-12, (2011).
- Hagler, J.R., Mueller, S., Teuber, L.R., Van Deynze, A., & Martin, J. A method for distinctly marking honey bees, Apis mellifera, originating from multiple apiary locations. J. Insect Sci. 11 (143), 1-14, (2011).
- Peck, G.W., Ferguson, H.J., Jones, V.P., O'Neal, S.D., & Walsh, D.B. Use of a highly sensitive immunomarking system to characterize face fly (Diptera: Muscidae) dispersal from cow pats. Environ. Entomol. 43 (1), 116-122, (2014).
- Boina, D.R., Meyer, W.L., Onagbola, E.O., & Stelinski, L.L. Quantifying dispersal of Diaphorina citri (Hemiptera: Psyllidae) by immunomarking and potential impact of unmanaged groves on commercial citrus management. Environ. Entomol. 38 (4), 1250-1258, (2009).
- Lewis-Rosenblum, H., Tawari, X.M.S., & Stelinski, L.L. Seasonal movement patterns and long-range dispersal of Asian citrus phyllid in Florida citrus. J. Econ. Entomol. 108 (1), 3-10, (2015).
- Krugner, R., Hagler, J.R., Groves, R.L., Sisterson, M.S., Morse, J.G., & Johnson, M.W. Plant water stress effects on the net dispersal rate of the insect vector, Homalodisca vitripennis (Germar) (Hemiptera: Cicadellidae), and movement of its egg parasitoid, Gonatocerus ashmeadi Girault (Hymenoptera: Mymaridae). Environ. Entomol. 41 (6), 1279-1289, (2012).
- Klick, J., et al. Distribution and activity of Drosophila suzukii in cultivated raspberry and surrounding vegetation. J. Appl. Entomol. (2015).
- Basoalto, K., Miranda, M., Knight, A.L., & Fuentes-Contreras, E. Landscape analysis of adult codling moth (Lepidoptera: Tortricidae) distribution and dispersal within typical agroecosystems dominated by apple production in Central Chile. Environ. Entomol. 39 (5), 1399-1408, (2010).
- Horton, D.R., Jones, V.P., & Unruh, T.R. Use of a new immunomarking method to assess movement by generalist predators between a cover crop and tree canopy in a pear orchard. Amer. Entomol. 55 (1), 49-56, (2009).
- Swezey, S.L., Nieto, D.J., Pickett, C.H., Hagler, J.R., Bryer, J.A., & Machtley, S.A. Spatial density and movement of the Lygus spp. parasitoid Peristenus relictus (Hymenoptera: Braconidae) in organic strawberries with alfalfa trap crops. Environ. Entomol. 43 (2), 363-369, (2014).
- Sivakoff, F.S., Rosenheim, J.A., & Hagler, J.R. Relative dispersal ability of a key agricultural pest and its predators in an annual agroecosystem. Biol. Control. 63 (3), 296-303, (2012).
- Slosky, L. M., Hoffmann, E. J., & Hagler, J. R. A comparative study of the retention and lethality of the first and second generation arthropod protein markers. Entomol. Exp. App. 144 (2), 165-171, (2012).
- Hagler, J.R., Machtley, S.A., & Blackmer, F. A potential contamination error associated with insect protein mark-capture data. Entomol. Exp. App. 154 (1), 28-34, (2015).
- Hagler, J.R., & Jones, V.P. A protein-based approach to mark arthropods for mark-capture type research. Entomol. Exp. App. 135 (2), 177-192, (2010).
- Hagler, J.R., Naranjo, S.E., Machtley, S.A., & Blackmer, F. Development of a standardized protein immunomarking protocol for insect mark-capture dispersal research. J. Appl. Entomol. 138 (10), 772-782, (2014).
- Hagler, J.R. Variation in the efficacy of several predator gut content immunoassays. Biol. Control. 12 (1), 25-32, (1998).
- Clark, M.F., & Adams, A.N. Characteristics of microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses. J. Gen. Virol. 34 (3), 475-483, (1977).
- Crowther, J.R. The ELISA guidebook. Humana Press. Totowa, NJ, (2001).
- Stimmann, M.W. Marking insects with rubidium: Imported cabbageworm marked in the field. Environ. Entomol. 3 (2), 327-328, (1974).
