Administrer et détecter des marques de protéines sur les arthropodes pour la dispersion de la recherche
Summary
Proteins are often used to mark arthropods for dispersal research. Methods for administering internal and external protein marks on arthropods are demonstrated. Protein mark detection techniques, either through indirect or sandwich enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs), are also illustrated.
Abstract
Le contrôle des mouvements des arthropodes est souvent nécessaire pour mieux comprendre la dynamique de la population, associés aux modèles de dispersion, les préférences de la plante hôte, et d'autres interactions écologiques. Arthropodes sont généralement suivis dans la nature en les étiquetant avec une marque unique et puis re-collecte eux au fil du temps et de l'espace pour déterminer leurs capacités de dispersion. En plus de balises physiques réelles, comme la poussière ou de la peinture de couleur, divers types de protéines sont avérées très efficaces pour les arthropodes pour la recherche écologique de marquage. Les protéines peuvent être administrées à l'intérieur et / ou extérieur. Les protéines peuvent ensuite être détectés sur les arthropodes recapturés avec un dosage immuno-enzymatique spécifique de la protéine (ELISA). Nous décrivons ici les protocoles pour extérieurement et intérieurement marquage arthropodes avec des protéines. Deux exemples expérimentaux simples sont démontrés: (1) une marque de protéine interne présenter à un insecte en fournissant une alimentation enrichie en protéines et (2) une marque de protéine externe topique d'unepplied à un insecte en utilisant un nébuliseur médical. Nous relions ensuite un guide étape par étape du sandwich et méthodes ELISA indirectes utilisées pour détecter les traces de protéines sur les insectes. Dans cette démonstration, les divers aspects de l'acquisition et la détection des marqueurs de protéines sur les arthropodes de marque à libération-recapture, marque-capture, et les types de recherche auto-marquage-capture sont discutés, ainsi que les diverses façons que la procédure d'immuno-marquage a été adapté pour convenir à une grande variété d'objectifs de recherche.
Introduction
Suivi des mouvements des arthropodes parasites, ennemis naturels (parasitoïdes et des prédateurs), et les pollinisateurs dans la nature est essentielle pour mieux comprendre comment améliorer les services écosystémiques. L'élément clé pour la plupart des types de recherche de dispersion est d'avoir une méthode fiable pour marquer l'arthropode (s) d'intérêt. Une variété de matériaux (par exemple, les peintures, les teintures, les poussières de couleur, des étiquettes, des éléments rares, protéines) ont été utilisées pour marquer les arthropodes pour évaluer la dynamique de leur population, les capacités de dispersion, les comportements alimentaires, et d'autres interactions écologiques 1,2.
La pertinence d'un marqueur utilisé pour toute recherche de dispersion donné sera fonction du type d'étude en cours. Il existe trois grandes catégorisations pour les arthropodes marquage: (1) marque à libération-recapture (MRR), (2) marque-capture, et (3) l'auto-marquage-capture. Pour la recherche marque à libération-recapture, l'enquêteur marque généralement les arthropodes collectivement dans le laborary et libère eux à un point central dans le domaine. Les arthropodes sont ensuite repris à divers intervalles spatiales et temporelles en utilisant différents dispositifs de collecte (par exemple, nets de balayage, sous vide, piège collant) 3,4,5. Les échantillons récupérés sont ensuite examinés pour la marque spécifique de distinguer libéré de personnes indigènes. Pour la recherche marque-capture, l'enquêteur applique généralement la marque directement dans l'équipement de pulvérisation sur le terrain à l'aide (par exemple, un pulvérisateur à dos, la rampe et buse pulvérisateur). Les meilleurs marqueurs pour la recherche marque de capture sont peu coûteux et facilement appliquée à l'habitat de l'arthropode. Pour la recherche d'auto-marquage-capture, l'enquêteur applique généralement aux marques une entrée arthropodes appât 6,7 ou 8 nid. À son tour, l'arthropode se marque en interne par dévorer l'appât ou à l'extérieur marqué par "brosser" contre la marque telle qu'elle quitte le nid.
Comme mentionné ci-dessus, de nombreux types de marqueurs ont été noused pour marquer une variété d'espèces d'arthropodes. Cependant, très peu sont utiles pour ces trois catégories de recherche dispersion. Le développement de la procédure protéine immuno-marquage était une percée majeure pour les insectes de marquage. Immunomarquage met une étiquette de protéine sur les arthropodes interne ou externe qui, à son tour, est détectée par un dosage immuno spécifique lié à une enzyme anti-protéine (ELISA). Les premiers marqueurs protéiques tels utilisées étaient immunoglobuline de lapin (IgG) et le poulet IgG / 9,10 IgY. Ils se sont révélés être des marques très efficaces pour MRR et de la recherche de soi-marquage-capture (voir la discussion). Malheureusement, les protéines IgG / IgY sont coûteux et ne sont donc pas pratique pour la recherche marque-capture et la plupart des types de recherche auto-marquage-capture. Par la suite, les tests ELISA de détection de la protéine de deuxième génération ont été développés pour des protéines contenues dans les blancs d'oeufs de poulet (albumine), le lait de vache (la caséine) et du lait de soja (protéine inhibitrice de la trypsine). Chaque essai est très sensible, spécifique et, plusSurtout, utilise des protéines qui sont beaucoup moins chers que les protéines IgG / 11 IgY. Ces protéines se sont avérés efficaces pour MRR, marque-capture, et la recherche de soi-marquage-capture (voir la discussion).
Dans cet article, nous décrivons et montrons comment réaliser des études de rétention de laboratoire protéines de marque. Ces études sont la première phase de la recherche nécessaire pour tout type d'étude champ de dispersion. Plus précisément, il est essentiel que les enquêteurs savent combien de temps la marque sera conservée sur les espèces d'arthropodes ciblés avant d'entreprendre des études champ de dispersion. Ici, nous décrire et démontrer comment marquer interne et externe des insectes pour MRR, marque de capture, et des études de terrain de type auto-marquage-capture. Nous démontrons comment pour détecter la présence des marques avec ELISA indirects et sandwichs.
Protocol
Representative Results
Discussion
La procédure d'immuno-marquage des protéines arthropode a été décrite pour la première près d'un quart de siècle 9. Depuis lors, la procédure a été adaptée pour étudier les modes de dispersion d'une grande variété d'arthropodes en utilisant IgG / IgY fois interne et externe administrés. Ces protéines se sont avérées marqueurs fermes pour la grande variété d'espèces d'insectes testées jusqu'à présent. Cependant, comme mentionné ci-dessus, la principale limi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le financement a été fourni par l'USDA CRIS 5347-22620-021-00D et, en partie, par l'Agriculture and Food Research Initiative concurrentiel Subvention pas. 2011-67009-30141 de l'Institut national de l'alimentation et de l'agriculture USDA. Nous sommes reconnaissants de l'appui technique de Johanna Nassif. Nous remercions également Paul Baker, David Horton, Diego Nieto, et Frances Sivakoff pour fournir certains des images utilisées dans la figure 3.
Materials
| Food storage container (for insect rearing) | Rubbermaid/Tupperware | Various sizes | Various manufacturers & vendors. Mesh fabric is glued in a window ` |
| Small volume nebulizer (Micro Mist) | Teleflex-Hudson RCI | 1881 | Available online and in medical supply shops. Other brands will work as well. |
| Microcentrifuge tubes, 1.6 ml w/cap | Continental Lab Products | 4445.X | Any similar type will work. We prefer brands that have easy to open lids. |
| Styrofoam storage box for microcentrifuge tubes (5×20 grid) | RPI Corp. | 145746 | This design is nice because it doesn't crowd the tubes. |
| Dispenser, repeater | Eppendorf | 4982000322 | Anything similar will help speed up the dispensing. |
| Pestles, plastic disposable tissue grinders, 1.5 mL | Kimble Chase | 749521-1500 | Available with various vendors. Pestles can be cleaned and autoclaved for reuse. |
| BD Falcon ELISA plates, 96-well (flat bottom) | BD | 351172 | |
| Ovation pipette, manual (20-200 µl) | VistaLab | 1057-0200 or 1070-0200 | Any similar type will work. This model is ergonomic. |
| Reservoirs, sterile reagent | VistaLab | 4054-1000 | Anything similar will work. |
| Electronic pipette, 8-channel (50-1200 µl) (Biohit eLine) | Sartorius | 730391 | If you had to pick one electronic model, this size is most useful. |
| Electronic pipette, 8-channel (10-300 µl) (Biohit eLine) | Sartorius | 730361 | Anything similar will work. |
| Manifold, multiwell plate washer (8-position, straight) | Sigma-Aldrich | Z369802 | Anything similar will work for manual plate washing. |
| Microplate reader with absorbance detection | Molecular Devices | SpectraMax 250 | Anything similar will work. |
| Chicken IgG/IgY | United States Biological | I1903-15R | Also available from other sources |
| Egg whites | Grocery store | “All Whites”, “Egg Beaters”, etc. | Mix 5 mL with 95 mL dH2O for 5% solution |
| Tris (Trizma Base) | Sigma-Aldrich | T1503 | 2.42 g/L to make TBS |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | 29.22 g/L to make TBS and 8.0 g/L for PBS |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S0876 | 1.14 g/L for PBS |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | 0.2 g/L for PBS |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | 0.2 g/L for PBS |
| Tween 20, EIA grade | Sigma-Aldrich | P1379 | Add 0.5 mL per L to PBS after salts are dissolved. |
| PBS with 1% BSA | Sigma-Aldrich | P3688 | Mix 1 packet in 1 L dH20 |
| Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule) antibody produced in rabbit (1:500) | Sigma-Aldrich | C6409 | Mix 100 µl in 50 ml TBS |
| Dry Milk, Powdered or Fresh Milk (1%) | Grocery store | Mix 10 g with 1 L dH2O for 1% solution | |
| Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule)-Peroxidase antibody produced in rabbit (1:10000) | Sigma-Aldrich | A9046 | Mix 100 ul in 1 L of 1% milk |
| Anti-Chicken Egg Albumin antibody produced in rabbit (1:8000) | Sigma-Aldrich | C6534 | Dilute 125 µl in 1 L PBS-BSA |
| Goat Anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate (1:2000) | Sigma-Aldrich | A6154 | Dilute 0.5 ml in 1 L PBS-BSA, then add 1.3 ml Silwet |
| Vac-In-Stuff (Silwet L-77)silicon-polyether copolymer | Lehle Seeds | VIS-01 | Add as last ingredient |
| TMB Microwell One Component Peroxidase Substrate | SurModics | TMBW-1000-01 |
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