Toedienen en het detecteren van eiwit Marks op Insecten voor Verspreiding Onderzoek
Summary
Proteins are often used to mark arthropods for dispersal research. Methods for administering internal and external protein marks on arthropods are demonstrated. Protein mark detection techniques, either through indirect or sandwich enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs), are also illustrated.
Abstract
Monitoring geleedpotige beweging is vaak nodig om geassocieerd populatiedynamiek, dispersie patronen, voorkeuren waardplant, en andere ecologische interacties beter te begrijpen. Geleedpotigen worden meestal bijgehouden in de natuur door tagging ze met een uniek merk en vervolgens opnieuw verzamelen ze in de tijd en ruimte om hun verspreiding vermogen te bepalen. Naast de fysieke markeringen, bijvoorbeeld gekleurde stof of verf, verschillende soorten eiwitten hebben bewezen zeer effectief voor het markeren van geleedpotigen ecologische onderzoek. Eiwitten kunnen inwendig en / of uitwendig worden toegediend. De eiwitten kunnen vervolgens worden gedetecteerd ingehaald geleedpotigen met een proteïne-specifieke enzym-gekoppelde immunosorbent assay (ELISA). Hier beschrijven we protocollen voor extern als intern tagging geleedpotigen met eiwit. Twee eenvoudige experimentele voorbeelden worden gedemonstreerd: (1) een intern eiwit merk geïntroduceerd om een insect door een eiwit verrijkte dieet en (2) een externe eiwit topisch een merktekenpplied een insect met een medische verstuiver. Vervolgens hebben we betrekking hebben een stap-voor-stap handleiding van de sandwich en indirecte ELISA methoden die worden gebruikt om eiwitten te merken detecteren op de insecten. In deze demonstratie worden verschillende aspecten van de overname en de detectie van eiwit markers op geleedpotigen merk afgifte-hervangst, mark-capture en soorten self-mark-capture van het onderzoek besproken, samen met de verschillende manieren waarop de immunomarking procedure is geweest aangepast om een groot aantal onderzoeksdoelen passen.
Introduction
Het volgen van de beweging van atropodenplagen, natuurlijke vijanden (parasieten en predatoren) en bestuivers in de natuur is van essentieel belang voor een beter begrip hoe de ecosysteemdiensten te verbeteren. De belangrijkste component voor de meeste dispersie onderzoek is een betrouwbare methode om de geleedpotigen (s) van belang coderen. Een verscheidenheid van materialen (bijvoorbeeld verven, kleurstoffen, gekleurde stof, markeringen, zeldzame elementen, eiwitten) zijn gebruikt om geleedpotigen markeren hun populatiedynamiek, dispersie capaciteiten beoordelen voeden gedrag en andere ecologische interacties 1,2.
De geschiktheid van een merker voor een bepaalde spreiding onderzoek afhankelijk van het type studie uitgevoerd zijn. Er zijn drie grote indelingen voor het markeren van geleedpotigen: (1) mark-afgifte herovering (MRR), (2) mark-capture, en (3) self-mark-capture. Voor mark-afgifte herovering onderzoek, de onderzoeker markeert meestal de geleedpotigen collectief in het laboratory en vrijgeeft op een centraal punt in het veld. De geleedpotigen worden vervolgens heroverd op verschillende ruimtelijke en temporele intervallen met behulp van verschillende inrichtingen (bijv sweep net, vacuüm, vangplaat) 3,4,5. De heroverd monsters worden vervolgens onderzocht op het specifieke merk te onderscheiden vrijgelaten uit inheemse individuen. Voor mark-capture onderzoek, de onderzoeker geldt meestal het merk direct in het veld met behulp van spuitapparatuur (bv rugzak sproeier, giek en nozzle spuit). De beste markers voor mark-capture onderzoek zijn goedkoop en gemakkelijk aan te brengen op de habitat van de geleedpotigen's. Voor self-mark-capture onderzoek, de onderzoeker geldt meestal merken een geleedpotigen aas 6,7 of nestingang 8. Op zijn beurt, de geleedpotigen markeert zelf intern door het verslinden van de gemarkeerde aas of extern door "borstelen" tegen de mark zodra ze uit het nest.
Zoals hierboven vermeld, zijn vele soorten markers ons geweested van verschillende geleedpotigen taggen. Echter, weinig bruikbaar voor alle drie de verspreiding onderzoekscategorieën. De ontwikkeling van het eiwit immunomarking procedure een grote doorbraak voor het markeren van insecten. Immunomarking zet een eiwit label geleedpotigen intern of extern die op zijn beurt wordt gedetecteerd met een anti-eiwit-specifieke enzym-gekoppelde immunosorbent assay (ELISA). De eerste dergelijke proteïne markers gebruikt waren konijn immunoglobuline (IgG) en kip IgG / IgY 9,10. Ze bleek te zijn zeer effectief punten voor MRR en zelf-mark-capture onderzoek (zie bespreking). Helaas, IgG / IgY eiwitten zijn duur en daarom niet praktisch voor mark-capture onderzoek en de meeste vormen van self-mark-capture onderzoek. Vervolgens werden de tweede generatie eiwitdetectie ELISA's ontwikkeld voor de eiwitten die in kip eiwit (albumine), koemelk (caseïne) en sojamelk (trypsineremmer eiwit). Elke test is zeer gevoelig, specifiek en,Belangrijker gebruikt eiwitten die veel goedkoper zijn dan de IgG / IgY eiwitten 11 zijn. Deze eiwitten zijn effectief voor MRR, mark-capture, en zelf-mark-capture onderzoek (zie bespreking) bewezen.
In dit artikel beschrijven we en demonstreren hoe eiwitten merk retentie laboratorium studies uit te voeren. Dergelijke onderzoeken zijn de eerste fase van het onderzoek voor elk type veld dispersie studie. Specifiek, is het essentieel dat de onderzoekers weten hoe lang de markering op de beoogde geleedpotigen worden gehandhaafd dan het opstarten van veld dispersie studies. Hier beschrijven we en laten zien hoe je intern en extern te markeren insecten voor MRR, mark-capture, en zelf-mark-capture veld type studies. Vervolgens hebben we laten zien hoe de aanwezigheid van de merken op te sporen met indirecte en sandwich ELISA.
Protocol
Representative Results
Discussion
De geleedpotigen eiwit immunomarking procedure werd voor het eerst beschreven bijna een kwart eeuw geleden 9. Sindsdien is de procedure aangepast aan de verspreiding patronen van een breed scala van geleedpotigen met behulp van zowel intern als extern beheerd IgG / IgYs bestuderen. Deze eiwitten zijn standvastig markers gebleken voor uiteenlopende insectensoorten tot nu toe getest. Zoals hierboven genoemd, de belangrijkste beperking voor het gebruik van IgG / IgYs is dat ze erg duur. Bijgevolg IgG / IgYs zijn…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De financiering werd verstrekt door USDA CRIS 5347-22620-021-00D en, gedeeltelijk, door de Landbouw en Voedselvoorziening Research Initiative Competitive Grant niet. 2011-67009-30141 van de USDA Nationaal Instituut voor Voedsel en Landbouw. We zijn dankbaar voor de technische ondersteuning van Johanna Nassif. We danken ook Paul Baker, David Horton, Diego Nieto en Frances Sivakoff voor het verstrekken van een aantal van de foto's die in figuur 3.
Materials
| Food storage container (for insect rearing) | Rubbermaid/Tupperware | Various sizes | Various manufacturers & vendors. Mesh fabric is glued in a window ` |
| Small volume nebulizer (Micro Mist) | Teleflex-Hudson RCI | 1881 | Available online and in medical supply shops. Other brands will work as well. |
| Microcentrifuge tubes, 1.6 ml w/cap | Continental Lab Products | 4445.X | Any similar type will work. We prefer brands that have easy to open lids. |
| Styrofoam storage box for microcentrifuge tubes (5×20 grid) | RPI Corp. | 145746 | This design is nice because it doesn't crowd the tubes. |
| Dispenser, repeater | Eppendorf | 4982000322 | Anything similar will help speed up the dispensing. |
| Pestles, plastic disposable tissue grinders, 1.5 mL | Kimble Chase | 749521-1500 | Available with various vendors. Pestles can be cleaned and autoclaved for reuse. |
| BD Falcon ELISA plates, 96-well (flat bottom) | BD | 351172 | |
| Ovation pipette, manual (20-200 µl) | VistaLab | 1057-0200 or 1070-0200 | Any similar type will work. This model is ergonomic. |
| Reservoirs, sterile reagent | VistaLab | 4054-1000 | Anything similar will work. |
| Electronic pipette, 8-channel (50-1200 µl) (Biohit eLine) | Sartorius | 730391 | If you had to pick one electronic model, this size is most useful. |
| Electronic pipette, 8-channel (10-300 µl) (Biohit eLine) | Sartorius | 730361 | Anything similar will work. |
| Manifold, multiwell plate washer (8-position, straight) | Sigma-Aldrich | Z369802 | Anything similar will work for manual plate washing. |
| Microplate reader with absorbance detection | Molecular Devices | SpectraMax 250 | Anything similar will work. |
| Chicken IgG/IgY | United States Biological | I1903-15R | Also available from other sources |
| Egg whites | Grocery store | “All Whites”, “Egg Beaters”, etc. | Mix 5 mL with 95 mL dH2O for 5% solution |
| Tris (Trizma Base) | Sigma-Aldrich | T1503 | 2.42 g/L to make TBS |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | 29.22 g/L to make TBS and 8.0 g/L for PBS |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S0876 | 1.14 g/L for PBS |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | 0.2 g/L for PBS |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | 0.2 g/L for PBS |
| Tween 20, EIA grade | Sigma-Aldrich | P1379 | Add 0.5 mL per L to PBS after salts are dissolved. |
| PBS with 1% BSA | Sigma-Aldrich | P3688 | Mix 1 packet in 1 L dH20 |
| Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule) antibody produced in rabbit (1:500) | Sigma-Aldrich | C6409 | Mix 100 µl in 50 ml TBS |
| Dry Milk, Powdered or Fresh Milk (1%) | Grocery store | Mix 10 g with 1 L dH2O for 1% solution | |
| Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule)-Peroxidase antibody produced in rabbit (1:10000) | Sigma-Aldrich | A9046 | Mix 100 ul in 1 L of 1% milk |
| Anti-Chicken Egg Albumin antibody produced in rabbit (1:8000) | Sigma-Aldrich | C6534 | Dilute 125 µl in 1 L PBS-BSA |
| Goat Anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate (1:2000) | Sigma-Aldrich | A6154 | Dilute 0.5 ml in 1 L PBS-BSA, then add 1.3 ml Silwet |
| Vac-In-Stuff (Silwet L-77)silicon-polyether copolymer | Lehle Seeds | VIS-01 | Add as last ingredient |
| TMB Microwell One Component Peroxidase Substrate | SurModics | TMBW-1000-01 |
References
- Hagler, J.R., & Jackson, C.G. Methods for marking insects: Current techniques and future prospects. Annu. Rev. Entomol. 46, 511-543, (2001).
- Lavandero, B.I., Wratten, S.E., Hagler, J.R., & Jervis, M.A. The need for effective marking and tracking techniques for monitoring the movements of insect predators and parasitoids. Int. J. Pest Manage. 50 (3), 147-151, (2004).
- Hagler, J.R., Jackson, C.G., Henneberry, T.J., & Gould, J. Parasitoid mark-release-recapture techniques: II. Development and application of a protein marking technique for Eretmocerus spp., parasitoids of Bemisia argentifolii. Biocontrol Sci. Techn. 12 (6), 661-675, (2002).
- Blackmer, J.L., Hagler, J.R., Simmons, G.S., & Henneberry, T.J. Dispersal of Homalodisca vitripennis (Homoptera: Cicadellidae) from a point release site in citrus. Environ. Entomol. 35 (6), 1617-1625, (2006).
- Swezey, S.L., Nieto, D.J., Hagler, J.R., Pickett, C.H., Bryer, J.A., & Machtley, S.A. Dispersion, distribution and movement of Lygus.spp. (Hemiptera: Miridae) in trap-cropped strawberries. Environ. Entomol. 42 (4), 770-778, (2013).
- Hagler, J.R., Baker, P.B., Marchosky, R., Machtley, S.A., Bellamy, D.E. Methods to mark termites with protein for mark-release-recapture and mark-capture studies. Insect. Soc. 56 (2), 213-220, (2009).
- Baker, P.B., et al. Utilizing rabbit immunoglobulin G protein for mark-capture studies on the desert subterranean termite, Heterotermes aureus (Snyder). Insect. Soc. 57 (2), 147-155, (2010).
- Hagler, J.R., Mueller, S., Teuber, L.R., Machtley, S.A., & Van Deynze, A. Foraging range of honey bees, Apis mellifera, in alfalfa seed production fields. J. Insect Sci. 11 (1), 1-12, (2011).
- Hagler, J.R., Cohen, A.C., Bradley-Dunlop, D., & Enriquez, F.J. A new approach to mark insects for feeding and dispersal studies. Environ. Entomol. 21 (1), 20-25, (1992).
- Hagler, J.R. Field retention of a novel mark-release-recapture method. Environ. Entomol. 26 (5), 1079-1086, (1997).
- Jones, V.P., Hagler, J.R., Brunner, J., Baker, C., & Wilburn, T. An inexpensive immunomarking technique for studying movement patterns of naturally occurring insect populations. Environ. Entomol. 35 (4), 827-836, (2006).
- Sivakoff, F.S., Rosenheim, J.A., & Hagler, J.R. Threshold choice and the analysis of protein marking data in long-distance dispersal studies. Methods Ecol. Evol. 2 (1), 77-85, (2011).
- Hagler, J.R., & Jackson, C.G. An immunomarking technique for labeling minute parasitoids. Environ. Entomol. 27 (4), 1010-1016, (1998).
- Janke, J., et al. Serological marking of Pnigalio agraules (Hymenoptera: Eulophidae) for field dispersal studies. J. Pest Sci. 82 (1), 47-53, (2009).
- DeGrandi-Hoffman, G., & Hagler J.R. The flow of incoming nectar through a honey bee (Apis mellifera L.) colony as revealed by a protein marker. Insect. Soc. 47 (4), 302-306, (2000).
- Peck, S.L., & McQuate, G.T. Ecological aspects of Bactrocera latifrons (Diptera: Tephritidae) on Maui, Hawaii: Movement and host preference. Environ. Entomol. 33 (6), 1722-1731, (2004).
- Hagler, J.R., & Durand, C.M. A new method for immunologically marking prey and its use in predation studies. Entomophaga. 39 (3), 257-265, (1994).
- Hagler, J.R. An immunological approach to quantify consumption of protein-tagged Lygus hesperus by the entire cotton predator assemblage. Biol. Control. 58 (3), 337-345, (2011).
- Fournier, V., Hagler, J.R., Daane, K., de Leòn, J., & Groves, R. Identifying the predator complex of Homalodisca vitripennis (Hemiptera: Cicadellidae): A comparative study of the efficacy of an ELISA and PCR gut content assay. Oecologia. 157 (4), 629-640, (2008).
- Hagler, J.R. Development of an immunological technique for identifying multiple predator–prey interactions in a complex arthropod assemblage. Ann. Appl. Biol. 149 (2), 153-165, (2006).
- Mansfield, S., Hagler, J.R., & Whitehouse, M. A comparative study of the efficiency of a pest-specific and prey-marking ELISA for detection of predation. Entomol. Exp. Appl. 127 (3), 199-206, (2008).
- Buczkowski, G., Wang, C., & Bennett, G. Immunomarking reveals food flow and feeding relationships in the eastern subterranean termite, Reticulitermes flavipes (Kollar). Environ. Entomol. 36 (1), 173-182, (2007).
- Lundgren, J.G., Saska, P., & Honĕk, A. Molecular approach to describing a seed-based food web: The post-dispersal granivore community of an invasive plant. Ecol. Evol. 3 (6) 1642-1652, (2013).
- Kelly, J.L., Hagler, J.R., & Kaplan, I. Semiochemical lures reduce emigration and enhance pest control services in open-field augmentation. Biol. Control. 71, 70-77, (2014).
- Zilnik, G. and Hagler, J.R. An immunological approach to distinguish arthropod viviphagy from necrophagy. BioControl. 58 (6), 807-814, (2013).
- Irvin, N.A., Hagler, J.R., & Hoddle, M.S. Laboratory investigation of triple marking the parasitoid, Gonatocerus ashmeadi (Hymenoptera: Mymaridae) with a fluorescent dye and two animal proteins. Entomol. Exp. App. 143 (1), 1-12, (2011).
- Hagler, J.R., Mueller, S., Teuber, L.R., Van Deynze, A., & Martin, J. A method for distinctly marking honey bees, Apis mellifera, originating from multiple apiary locations. J. Insect Sci. 11 (143), 1-14, (2011).
- Peck, G.W., Ferguson, H.J., Jones, V.P., O'Neal, S.D., & Walsh, D.B. Use of a highly sensitive immunomarking system to characterize face fly (Diptera: Muscidae) dispersal from cow pats. Environ. Entomol. 43 (1), 116-122, (2014).
- Boina, D.R., Meyer, W.L., Onagbola, E.O., & Stelinski, L.L. Quantifying dispersal of Diaphorina citri (Hemiptera: Psyllidae) by immunomarking and potential impact of unmanaged groves on commercial citrus management. Environ. Entomol. 38 (4), 1250-1258, (2009).
- Lewis-Rosenblum, H., Tawari, X.M.S., & Stelinski, L.L. Seasonal movement patterns and long-range dispersal of Asian citrus phyllid in Florida citrus. J. Econ. Entomol. 108 (1), 3-10, (2015).
- Krugner, R., Hagler, J.R., Groves, R.L., Sisterson, M.S., Morse, J.G., & Johnson, M.W. Plant water stress effects on the net dispersal rate of the insect vector, Homalodisca vitripennis (Germar) (Hemiptera: Cicadellidae), and movement of its egg parasitoid, Gonatocerus ashmeadi Girault (Hymenoptera: Mymaridae). Environ. Entomol. 41 (6), 1279-1289, (2012).
- Klick, J., et al. Distribution and activity of Drosophila suzukii in cultivated raspberry and surrounding vegetation. J. Appl. Entomol. (2015).
- Basoalto, K., Miranda, M., Knight, A.L., & Fuentes-Contreras, E. Landscape analysis of adult codling moth (Lepidoptera: Tortricidae) distribution and dispersal within typical agroecosystems dominated by apple production in Central Chile. Environ. Entomol. 39 (5), 1399-1408, (2010).
- Horton, D.R., Jones, V.P., & Unruh, T.R. Use of a new immunomarking method to assess movement by generalist predators between a cover crop and tree canopy in a pear orchard. Amer. Entomol. 55 (1), 49-56, (2009).
- Swezey, S.L., Nieto, D.J., Pickett, C.H., Hagler, J.R., Bryer, J.A., & Machtley, S.A. Spatial density and movement of the Lygus spp. parasitoid Peristenus relictus (Hymenoptera: Braconidae) in organic strawberries with alfalfa trap crops. Environ. Entomol. 43 (2), 363-369, (2014).
- Sivakoff, F.S., Rosenheim, J.A., & Hagler, J.R. Relative dispersal ability of a key agricultural pest and its predators in an annual agroecosystem. Biol. Control. 63 (3), 296-303, (2012).
- Slosky, L. M., Hoffmann, E. J., & Hagler, J. R. A comparative study of the retention and lethality of the first and second generation arthropod protein markers. Entomol. Exp. App. 144 (2), 165-171, (2012).
- Hagler, J.R., Machtley, S.A., & Blackmer, F. A potential contamination error associated with insect protein mark-capture data. Entomol. Exp. App. 154 (1), 28-34, (2015).
- Hagler, J.R., & Jones, V.P. A protein-based approach to mark arthropods for mark-capture type research. Entomol. Exp. App. 135 (2), 177-192, (2010).
- Hagler, J.R., Naranjo, S.E., Machtley, S.A., & Blackmer, F. Development of a standardized protein immunomarking protocol for insect mark-capture dispersal research. J. Appl. Entomol. 138 (10), 772-782, (2014).
- Hagler, J.R. Variation in the efficacy of several predator gut content immunoassays. Biol. Control. 12 (1), 25-32, (1998).
- Clark, M.F., & Adams, A.N. Characteristics of microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses. J. Gen. Virol. 34 (3), 475-483, (1977).
- Crowther, J.R. The ELISA guidebook. Humana Press. Totowa, NJ, (2001).
- Stimmann, M.W. Marking insects with rubidium: Imported cabbageworm marked in the field. Environ. Entomol. 3 (2), 327-328, (1974).
