إدارة والكشف عن علامات البروتين على المفصليات للبحوث تشتت
Summary
Proteins are often used to mark arthropods for dispersal research. Methods for administering internal and external protein marks on arthropods are demonstrated. Protein mark detection techniques, either through indirect or sandwich enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs), are also illustrated.
Abstract
وغالبا ما يتطلب مراقبة الحركة المفصلية إلى فهم أفضل لديناميات المرتبطة السكاني وأنماط النثر، وتفضيلات النبات المضيف، والتفاعلات البيئية الأخرى. وعادة ما تعقب المفصليات في الطبيعة عن طريق وضع علامات عليها مع علامة فريدة من نوعها ومن ثم إعادة جمعها عبر الزمان والمكان لتحديد قدرات تشتتهم. بالإضافة إلى علامات المادية الفعلية، مثل الغبار الملون أو الطلاء، وأثبتت أنواع مختلفة من البروتينات فعالة جدا لوسم المفصليات للبحث البيئي. البروتينات يمكن أن تدار داخليا و / أو خارجيا. ويمكن بعد ذلك يتم الكشف عن البروتينات على المفصليات استعادت مع انزيم مرتبط المناعي فحص بروتين معين (ELISA). نحن هنا وصف بروتوكولات للخارجيا وداخليا علامات المفصليات مع البروتين. وأظهرت مثالين تجريبية بسيطة: (1) علامة البروتين الداخلية التي أدخلت على حشرة من خلال توفير نظام غذائي التخصيب من البروتين و (2) علامة البروتين الخارجية موضعيا لpplied لحشرة باستخدام البخاخات الطبية. نحن ثم تتصل دليل خطوة بخطوة من الساندويتش وطرق ELISA غير المباشرة المستخدمة للكشف عن علامات البروتين على الحشرات. في هذه المظاهرة، وتناقش مختلف جوانب اقتناء وكشف عن علامات البروتين على المفصليات للعلامة الافراج عن الاستيلاء، علامة التقاط، وأنواع علامة التقاط النفس من البحوث، جنبا إلى جنب مع مختلف الطرق التي كان الإجراء immunomarking تكييفها لتلائم مجموعة واسعة من أهداف البحث.
Introduction
تتبع حركة الآفات المفصلية، وأعداء الطبيعية (الطفيليات والمفترسات)، والملقحات في الطبيعة أمر ضروري لفهم أفضل لكيفية تحسين خدمات النظام الإيكولوجي. المكون الرئيسي لمعظم أنواع البحوث تشتت هو وجود طريقة يمكن الاعتماد عليها لوضع علامة على المفصلية (ق) من الفائدة. مجموعة متنوعة من المواد (على سبيل المثال، والدهانات والأصباغ والأتربة الملونة، والعلامات، والعناصر النادرة، البروتينات) وقد استخدمت للاحتفال المفصليات لتقييم ديناميات السكان، وتشتيت قدراته، والتغذية والسلوكيات، والتفاعلات البيئية الأخرى 1،2.
ومدى ملاءمة علامة تستخدم لتفريق أي بحث معين يتوقف على نوع الدراسة التي تجري. هناك ثلاثة تصنيفات واسعة لوضع علامات المفصليات: (1) علامة الإفراج الاستيلاء (MRR)، (2) علامة التقاط، و (3) علامة التقاط النفس. للبحث علامة الافراج عن الاستيلاء، المحقق عادة يصادف المفصليات جماعي في laboratoراي والنشرات لهم في نقطة مركزية في هذا المجال. ثم استعادت المفصليات في مختلف فترات الزمنية والمكانية باستخدام أجهزة جمع مختلفة (على سبيل المثال، شبكة الاجتياح، فراغ، فخ لزجة) 3،4،5. ثم يتم فحص العينات استعاد لعلامة محددة للتمييز الإفراج عن أفراد الأصلي. للبحث علامة التقاط، المحقق عادة تنطبق علامة مباشرة في مجال استخدام معدات الرش (على سبيل المثال، بخاخ على ظهره، والازدهار وبخاخ فوهة). أفضل علامات للبحوث علامة التقاط غير مكلفة وتطبيقها بسهولة على الموائل والمفصلية ل. للبحث علامة التقاط النفس، المحقق عادة تنطبق علامات إلى الطعم المفصلية 6،7 أو عش مدخل 8. في المقابل، فإن المفصلية يمثل نفسه داخليا من قبل التهام الطعم ملحوظ أو خارجيا من قبل "تنظيف" حتى مقابل المارك فور خروجها من العش.
كما ذكر أعلاه، فقد كان لنا العديد من أنواع علاماتإد وضع علامة مجموعة متنوعة من الأنواع المفصلية. ومع ذلك، عدد قليل جدا مفيدة للجميع ثلاثة من هذه الفئات البحوث النثر. وكان التطور الإجراء البروتين immunomarking انجازا كبيرا لوسم الحشرات. Immunomarking يضع تسمية البروتين على المفصليات سواء داخليا أو خارجيا والتي، بدورها، تم الكشف من قبل انزيم مرتبط المناعي فحص محدد لمكافحة البروتين (ELISA). وكانت أول علامات هذا البروتين المناعي تستخدم الأرانب (مفتش) والدجاج مفتش / IGY 9،10. فإنها تبين أن علامات فعالة جدا لMRR والبحوث علامة التقاط النفس (انظر المناقشة). للأسف، والبروتينات مفتش / IGY مكلفة وبالتالي فهي ليست عملية للبحث علامة التقاط ومعظم أنواع البحوث علامة التقاط النفس. وفي وقت لاحق، تم تطوير الجيل الثاني من ELISAs كشف عن البروتين للبروتينات الموجودة في بياض البيض الدجاج (الزلال)، حليب البقر (الكازين) وحليب الصويا (التربسين البروتين المانع). كل فحص حساس جدا ومحددة، وأكثرالأهم من ذلك، يستخدم البروتينات التي هي أقل تكلفة بكثير من البروتينات مفتش / IGY 11. وقد أثبتت هذه البروتينات الفعال لMRR، علامة التقاط، والبحوث علامة التقاط النفس (انظر المناقشة).
في هذه المقالة، وصفنا وشرح كيفية إجراء علامة البروتين الدراسات الاحتفاظ المختبر. مثل هذه الدراسات هي المرحلة الأولى من الأبحاث اللازمة لأي نوع من الدراسة تشتت المجال. على وجه التحديد، فمن الأهمية بمكان أن المحققين أعرف كم من الوقت سيتم الاحتفاظ علامة على الأنواع المفصلية المستهدفة قبل الشروع في دراسات تشتت المجال. هنا، وصفنا وشرح كيفية داخليا وخارجيا بمناسبة الحشرات لMRR، علامة التقاط، وعلامة التقاط النفس دراسات نوع الحقل. نحن بعد ذلك شرح كيفية الكشف عن وجود علامات مع ELISAs غير المباشرة وشطيرة.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد وصفت الإجراء immunomarking البروتين المفصلية أول ما يقرب من ربع قرن منذ 9. منذ ذلك الحين، تم تكييفها الإجراء لدراسة أنماط تشتت تشكيلة واسعة من المفصليات باستخدام تدار داخليا وخارجيا مفتش / IgYs. وقد أثبتت هذه البروتينات علامات ثابتة لمجموعة واسعة من أنواع الحشرات اخ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم توفير التمويل من قبل وزارة الزراعة الأميركية كريس 5347-22620-021-00D و، في جزء منه، من قبل الزراعة والأغذية بحوث مبادرة التنافسية منحة لا. 2011-67009-30141 من المعهد الوطني USDA الأغذية والزراعة. ونحن ممتنون للدعم الفني للجوانا ناصيف. كما نشكر بول بيكر، ديفيد هورتون، دييغو نييتو، وفرانسيس Sivakoff لتوفير بعض الصور المستخدمة في الشكل (3).
Materials
| Food storage container (for insect rearing) | Rubbermaid/Tupperware | Various sizes | Various manufacturers & vendors. Mesh fabric is glued in a window ` |
| Small volume nebulizer (Micro Mist) | Teleflex-Hudson RCI | 1881 | Available online and in medical supply shops. Other brands will work as well. |
| Microcentrifuge tubes, 1.6 ml w/cap | Continental Lab Products | 4445.X | Any similar type will work. We prefer brands that have easy to open lids. |
| Styrofoam storage box for microcentrifuge tubes (5×20 grid) | RPI Corp. | 145746 | This design is nice because it doesn't crowd the tubes. |
| Dispenser, repeater | Eppendorf | 4982000322 | Anything similar will help speed up the dispensing. |
| Pestles, plastic disposable tissue grinders, 1.5 mL | Kimble Chase | 749521-1500 | Available with various vendors. Pestles can be cleaned and autoclaved for reuse. |
| BD Falcon ELISA plates, 96-well (flat bottom) | BD | 351172 | |
| Ovation pipette, manual (20-200 µl) | VistaLab | 1057-0200 or 1070-0200 | Any similar type will work. This model is ergonomic. |
| Reservoirs, sterile reagent | VistaLab | 4054-1000 | Anything similar will work. |
| Electronic pipette, 8-channel (50-1200 µl) (Biohit eLine) | Sartorius | 730391 | If you had to pick one electronic model, this size is most useful. |
| Electronic pipette, 8-channel (10-300 µl) (Biohit eLine) | Sartorius | 730361 | Anything similar will work. |
| Manifold, multiwell plate washer (8-position, straight) | Sigma-Aldrich | Z369802 | Anything similar will work for manual plate washing. |
| Microplate reader with absorbance detection | Molecular Devices | SpectraMax 250 | Anything similar will work. |
| Chicken IgG/IgY | United States Biological | I1903-15R | Also available from other sources |
| Egg whites | Grocery store | “All Whites”, “Egg Beaters”, etc. | Mix 5 mL with 95 mL dH2O for 5% solution |
| Tris (Trizma Base) | Sigma-Aldrich | T1503 | 2.42 g/L to make TBS |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | 29.22 g/L to make TBS and 8.0 g/L for PBS |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S0876 | 1.14 g/L for PBS |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | 0.2 g/L for PBS |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | 0.2 g/L for PBS |
| Tween 20, EIA grade | Sigma-Aldrich | P1379 | Add 0.5 mL per L to PBS after salts are dissolved. |
| PBS with 1% BSA | Sigma-Aldrich | P3688 | Mix 1 packet in 1 L dH20 |
| Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule) antibody produced in rabbit (1:500) | Sigma-Aldrich | C6409 | Mix 100 µl in 50 ml TBS |
| Dry Milk, Powdered or Fresh Milk (1%) | Grocery store | Mix 10 g with 1 L dH2O for 1% solution | |
| Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule)-Peroxidase antibody produced in rabbit (1:10000) | Sigma-Aldrich | A9046 | Mix 100 ul in 1 L of 1% milk |
| Anti-Chicken Egg Albumin antibody produced in rabbit (1:8000) | Sigma-Aldrich | C6534 | Dilute 125 µl in 1 L PBS-BSA |
| Goat Anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate (1:2000) | Sigma-Aldrich | A6154 | Dilute 0.5 ml in 1 L PBS-BSA, then add 1.3 ml Silwet |
| Vac-In-Stuff (Silwet L-77)silicon-polyether copolymer | Lehle Seeds | VIS-01 | Add as last ingredient |
| TMB Microwell One Component Peroxidase Substrate | SurModics | TMBW-1000-01 |
References
- Hagler, J.R., & Jackson, C.G. Methods for marking insects: Current techniques and future prospects. Annu. Rev. Entomol. 46, 511-543, (2001).
- Lavandero, B.I., Wratten, S.E., Hagler, J.R., & Jervis, M.A. The need for effective marking and tracking techniques for monitoring the movements of insect predators and parasitoids. Int. J. Pest Manage. 50 (3), 147-151, (2004).
- Hagler, J.R., Jackson, C.G., Henneberry, T.J., & Gould, J. Parasitoid mark-release-recapture techniques: II. Development and application of a protein marking technique for Eretmocerus spp., parasitoids of Bemisia argentifolii. Biocontrol Sci. Techn. 12 (6), 661-675, (2002).
- Blackmer, J.L., Hagler, J.R., Simmons, G.S., & Henneberry, T.J. Dispersal of Homalodisca vitripennis (Homoptera: Cicadellidae) from a point release site in citrus. Environ. Entomol. 35 (6), 1617-1625, (2006).
- Swezey, S.L., Nieto, D.J., Hagler, J.R., Pickett, C.H., Bryer, J.A., & Machtley, S.A. Dispersion, distribution and movement of Lygus.spp. (Hemiptera: Miridae) in trap-cropped strawberries. Environ. Entomol. 42 (4), 770-778, (2013).
- Hagler, J.R., Baker, P.B., Marchosky, R., Machtley, S.A., Bellamy, D.E. Methods to mark termites with protein for mark-release-recapture and mark-capture studies. Insect. Soc. 56 (2), 213-220, (2009).
- Baker, P.B., et al. Utilizing rabbit immunoglobulin G protein for mark-capture studies on the desert subterranean termite, Heterotermes aureus (Snyder). Insect. Soc. 57 (2), 147-155, (2010).
- Hagler, J.R., Mueller, S., Teuber, L.R., Machtley, S.A., & Van Deynze, A. Foraging range of honey bees, Apis mellifera, in alfalfa seed production fields. J. Insect Sci. 11 (1), 1-12, (2011).
- Hagler, J.R., Cohen, A.C., Bradley-Dunlop, D., & Enriquez, F.J. A new approach to mark insects for feeding and dispersal studies. Environ. Entomol. 21 (1), 20-25, (1992).
- Hagler, J.R. Field retention of a novel mark-release-recapture method. Environ. Entomol. 26 (5), 1079-1086, (1997).
- Jones, V.P., Hagler, J.R., Brunner, J., Baker, C., & Wilburn, T. An inexpensive immunomarking technique for studying movement patterns of naturally occurring insect populations. Environ. Entomol. 35 (4), 827-836, (2006).
- Sivakoff, F.S., Rosenheim, J.A., & Hagler, J.R. Threshold choice and the analysis of protein marking data in long-distance dispersal studies. Methods Ecol. Evol. 2 (1), 77-85, (2011).
- Hagler, J.R., & Jackson, C.G. An immunomarking technique for labeling minute parasitoids. Environ. Entomol. 27 (4), 1010-1016, (1998).
- Janke, J., et al. Serological marking of Pnigalio agraules (Hymenoptera: Eulophidae) for field dispersal studies. J. Pest Sci. 82 (1), 47-53, (2009).
- DeGrandi-Hoffman, G., & Hagler J.R. The flow of incoming nectar through a honey bee (Apis mellifera L.) colony as revealed by a protein marker. Insect. Soc. 47 (4), 302-306, (2000).
- Peck, S.L., & McQuate, G.T. Ecological aspects of Bactrocera latifrons (Diptera: Tephritidae) on Maui, Hawaii: Movement and host preference. Environ. Entomol. 33 (6), 1722-1731, (2004).
- Hagler, J.R., & Durand, C.M. A new method for immunologically marking prey and its use in predation studies. Entomophaga. 39 (3), 257-265, (1994).
- Hagler, J.R. An immunological approach to quantify consumption of protein-tagged Lygus hesperus by the entire cotton predator assemblage. Biol. Control. 58 (3), 337-345, (2011).
- Fournier, V., Hagler, J.R., Daane, K., de Leòn, J., & Groves, R. Identifying the predator complex of Homalodisca vitripennis (Hemiptera: Cicadellidae): A comparative study of the efficacy of an ELISA and PCR gut content assay. Oecologia. 157 (4), 629-640, (2008).
- Hagler, J.R. Development of an immunological technique for identifying multiple predator–prey interactions in a complex arthropod assemblage. Ann. Appl. Biol. 149 (2), 153-165, (2006).
- Mansfield, S., Hagler, J.R., & Whitehouse, M. A comparative study of the efficiency of a pest-specific and prey-marking ELISA for detection of predation. Entomol. Exp. Appl. 127 (3), 199-206, (2008).
- Buczkowski, G., Wang, C., & Bennett, G. Immunomarking reveals food flow and feeding relationships in the eastern subterranean termite, Reticulitermes flavipes (Kollar). Environ. Entomol. 36 (1), 173-182, (2007).
- Lundgren, J.G., Saska, P., & Honĕk, A. Molecular approach to describing a seed-based food web: The post-dispersal granivore community of an invasive plant. Ecol. Evol. 3 (6) 1642-1652, (2013).
- Kelly, J.L., Hagler, J.R., & Kaplan, I. Semiochemical lures reduce emigration and enhance pest control services in open-field augmentation. Biol. Control. 71, 70-77, (2014).
- Zilnik, G. and Hagler, J.R. An immunological approach to distinguish arthropod viviphagy from necrophagy. BioControl. 58 (6), 807-814, (2013).
- Irvin, N.A., Hagler, J.R., & Hoddle, M.S. Laboratory investigation of triple marking the parasitoid, Gonatocerus ashmeadi (Hymenoptera: Mymaridae) with a fluorescent dye and two animal proteins. Entomol. Exp. App. 143 (1), 1-12, (2011).
- Hagler, J.R., Mueller, S., Teuber, L.R., Van Deynze, A., & Martin, J. A method for distinctly marking honey bees, Apis mellifera, originating from multiple apiary locations. J. Insect Sci. 11 (143), 1-14, (2011).
- Peck, G.W., Ferguson, H.J., Jones, V.P., O'Neal, S.D., & Walsh, D.B. Use of a highly sensitive immunomarking system to characterize face fly (Diptera: Muscidae) dispersal from cow pats. Environ. Entomol. 43 (1), 116-122, (2014).
- Boina, D.R., Meyer, W.L., Onagbola, E.O., & Stelinski, L.L. Quantifying dispersal of Diaphorina citri (Hemiptera: Psyllidae) by immunomarking and potential impact of unmanaged groves on commercial citrus management. Environ. Entomol. 38 (4), 1250-1258, (2009).
- Lewis-Rosenblum, H., Tawari, X.M.S., & Stelinski, L.L. Seasonal movement patterns and long-range dispersal of Asian citrus phyllid in Florida citrus. J. Econ. Entomol. 108 (1), 3-10, (2015).
- Krugner, R., Hagler, J.R., Groves, R.L., Sisterson, M.S., Morse, J.G., & Johnson, M.W. Plant water stress effects on the net dispersal rate of the insect vector, Homalodisca vitripennis (Germar) (Hemiptera: Cicadellidae), and movement of its egg parasitoid, Gonatocerus ashmeadi Girault (Hymenoptera: Mymaridae). Environ. Entomol. 41 (6), 1279-1289, (2012).
- Klick, J., et al. Distribution and activity of Drosophila suzukii in cultivated raspberry and surrounding vegetation. J. Appl. Entomol. (2015).
- Basoalto, K., Miranda, M., Knight, A.L., & Fuentes-Contreras, E. Landscape analysis of adult codling moth (Lepidoptera: Tortricidae) distribution and dispersal within typical agroecosystems dominated by apple production in Central Chile. Environ. Entomol. 39 (5), 1399-1408, (2010).
- Horton, D.R., Jones, V.P., & Unruh, T.R. Use of a new immunomarking method to assess movement by generalist predators between a cover crop and tree canopy in a pear orchard. Amer. Entomol. 55 (1), 49-56, (2009).
- Swezey, S.L., Nieto, D.J., Pickett, C.H., Hagler, J.R., Bryer, J.A., & Machtley, S.A. Spatial density and movement of the Lygus spp. parasitoid Peristenus relictus (Hymenoptera: Braconidae) in organic strawberries with alfalfa trap crops. Environ. Entomol. 43 (2), 363-369, (2014).
- Sivakoff, F.S., Rosenheim, J.A., & Hagler, J.R. Relative dispersal ability of a key agricultural pest and its predators in an annual agroecosystem. Biol. Control. 63 (3), 296-303, (2012).
- Slosky, L. M., Hoffmann, E. J., & Hagler, J. R. A comparative study of the retention and lethality of the first and second generation arthropod protein markers. Entomol. Exp. App. 144 (2), 165-171, (2012).
- Hagler, J.R., Machtley, S.A., & Blackmer, F. A potential contamination error associated with insect protein mark-capture data. Entomol. Exp. App. 154 (1), 28-34, (2015).
- Hagler, J.R., & Jones, V.P. A protein-based approach to mark arthropods for mark-capture type research. Entomol. Exp. App. 135 (2), 177-192, (2010).
- Hagler, J.R., Naranjo, S.E., Machtley, S.A., & Blackmer, F. Development of a standardized protein immunomarking protocol for insect mark-capture dispersal research. J. Appl. Entomol. 138 (10), 772-782, (2014).
- Hagler, J.R. Variation in the efficacy of several predator gut content immunoassays. Biol. Control. 12 (1), 25-32, (1998).
- Clark, M.F., & Adams, A.N. Characteristics of microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses. J. Gen. Virol. 34 (3), 475-483, (1977).
- Crowther, J.R. The ELISA guidebook. Humana Press. Totowa, NJ, (2001).
- Stimmann, M.W. Marking insects with rubidium: Imported cabbageworm marked in the field. Environ. Entomol. 3 (2), 327-328, (1974).
