分离和流式细胞仪分析从缺血小鼠脑免疫细胞

所有的动物实验必须符合动物保健根据标准 （例如，该指南实验动物卫生，NIH出版号85-23美国国立研究院公布的维护和使用的1996年修订），并有被批准由相应的国家权威机构。 1.试剂的制备消化缓冲液（1毫升每半球）：将纯化的消化酶，例如一个标准化的混合物，LIBERASE低嗜热菌浓度（TL）至2U / ml，在Hanks平衡盐溶液（HBSS）中含有的钙的浓度（Ca）和镁（Mg）的洗涤缓冲液用DNA酶：将DNA酶I至在HBSS一个的666U / ml的浓度（钙/镁免费）含胎牛血清10％（FCS）的含10％FCS的HBSS（钙/镁免费）：洗涤液无DNA酶密度梯度介质（5毫升，每半球）：准备股票等渗密度梯度0;介质（SIP 100％）通过混合九个部分密度梯度介质的同一个部分的1.5M氯化钠。通过加入HBSS含FCS的3％的适当体积（钙/镁免费）稀释的SIP至25％的密度流式细胞术（FC）缓冲液：含FCS的3％的准备的磷酸盐缓冲盐水（PBS） 2.短暂大脑中动脉闭塞注意：通过腔内缝合技术瞬态大脑中动脉闭塞（MCAO）是在12周龄雄性C57BL / 6小鼠18前面所述进行。 简言之，麻醉用100％氧气2.0％异氟烷的小鼠。维持体温在36.5℃下由一个反馈控制的加热装置±0.5℃。 颈总动脉和颈外动脉结扎后，介绍在颈总动脉并推进它的标准化硅橡胶涂覆单丝对中间C的原点erebral动脉。 45分钟后，取出长丝，以允许再灌注。在假手术动物中，闭塞中脑动脉，以避免局部缺血之后立即撤回灯丝。 3.穿心灌注和脑解剖由管的一端浸入冰冷的HBSS（钙/镁免费）制备蠕动灌注泵。固定钝23政针到灌注管的另一端和开关泵上以完全填充用HBSS（钙/镁免费）的管。 深深地麻醉小鼠用4％的异氟醚和二氧化碳吸入安乐死。 将鼠标背部嵌在一个塑料托盘的夹层板。传播脱颖而出并在尽可能广泛和解决这些问题与20G针的夹层板后爪。 抓住腹部皮肤采用了直板1×2牙钳和用锋利的虹膜剪，使通过体壁和腹壁外侧切口和揭露肝。 提起胸骨和用锋利/钝虹膜剪钝刀刃切割膜片。继续切割在两侧的横向肋笼caudocranial方向。要小心，不要伤害肺部，心脏和胸动脉。 提起皮瓣用钝镊子，针它放在夹层板。使用钝头镊子和剪刀仔细的心脏结缔组织分开。 保持心脏用钝头镊子和插入钝23政针与所连接的输液管的尖端插入左心室心尖。注意：不要太远针头插入左心室，避免室间隔伤害。如果有必要，修复到位套管用直锋利的钳。 用锋利的虹膜剪切开右心房，并立即打开所述泵（流速：8 – 10ml /分钟）。 继续灌注，直到肝显示出光咖色（〜30毫升的HBSS）。始终灌注，小心地避免在管道的任何气泡的形成。 斩首直手术剪仅次于头颅鼠标。使用虹膜剪，使头皮正中切口，暴露头骨。 将尖锐的虹膜剪一个尖端插入枕骨大孔和横向切入头骨。重复另一侧。 用锋利的虹膜剪小心地从同一腔，迈向鼻子中线切割。尽量保持如过眼云烟尽可能剪刀年底，以避免大脑损伤。 用细镊子轻轻地从每个大脑半球剥离颅骨。注意：梗塞组织可能会附着在脑膜或颅骨;确保不失去的脑组织由于不谨慎解剖提起大脑用抹刀和用锋利的虹膜剪仔细剖析其固定在头骨颅神经纤维。放置脑入15毫升管填充用10ml HBSS（+钙/镁），并保持它那hortly冰上。 4.解离脑组织的单细胞悬浮液小心地取出脑干及小脑用干净的刀片。使用干净的刀片到hemisect脑和切割沿冠状面每个半球成三件大致相等的尺寸。 剁碎使用5毫升注射器的柱塞端解剖每个半球的组织通过100微米的细胞滤网。连续冲洗用冰冷的HBSS（+钙/镁）的细胞过滤网。在刨冰店匀浆样本。 离心机在286 XG和4℃下5分钟，小心弃去上清液。重悬在1ml的消化缓冲液中的颗粒和悬浮液转移到2ml管中。在37℃下缓慢连续旋转孵育停牌1小时。 通过一个70微米的细胞滤网筛细胞悬液，并用3毫升含DNA酶的洗涤缓冲液，接着15自由DNA酶洗涤缓冲液彻底冲洗。离心机在286 xg离心和18℃进行5分钟，并弃去上清液。注：注：使用DNA酶消除由细胞裂解可能导致细胞聚集损害细胞存活DNA粘液。 5.密度梯度离心为髓鞘和细胞碎片的去除在5毫升25％的密度梯度介质和吸取的悬浮液至15毫升管悬浮细胞沉淀。通过反复轻柔吹打避免泡沫的形成调匀。注意：密度梯度介质应当在RT用于防止细胞聚集。 离心机在521 xg离心和18℃20分钟。使用转子的最低加速曲线，让转子停不带刹车。轻轻地取出从离心机管无晃动。小心吸髓鞘涂层并将上清液，同时保留在管底部的细胞沉淀。注意：请务必删除整个髓鞘外衣任何剩余的将impaiR流量流式细胞仪分析。 重悬在10毫升DNA酶游离洗涤缓冲液的颗粒和吸取悬浮液到一个新的15ml试管。注意：此洗涤步骤是关键的，因为充分除去密度梯度介质的显著有助于最终细胞样品的数量和质量。 离心再次在286 xg离心和10℃5分钟并弃上清。重悬在100μl冷洗涤缓冲液中的细胞，并通过用血细胞计数器台盼蓝排除测定细胞计数和活力。在4℃储存的样本，迅速进一步处理它们。 6.抗体染色的流式细胞仪分析之前抗体标记，孵育细胞悬浮液在4℃下用抗鼠CD16 / CD32的FC-受体阻断剂10分钟（2.5微克/毫升的最终浓度，稀释因子1：200），以防止非特异性结合。 添加荧光团共轭的初级抗体在一个ppropriate浓度（如表 1所示），以细胞悬浮液，并在4℃下孵育在黑暗中20分钟。注：对照样品不与初级抗体染色，但其它处理相同。 在350 xg离心洗涤细胞用2ml的FC缓冲器和离心机和10℃7 min.Carefully吸在200μlFC缓冲器的上清，重悬细胞沉淀。店内暂时的样品在4℃在黑暗中，直到流式细胞仪分析。 7.绝对定量计数珠反向吸取FC缓冲器40微升和10微升细胞悬浮液到含有已知数量的荧光珠的计数管中。注：移液器校准提供准确的10微升样品作为白细胞计数的后续计量是指本卷注意。 孵化用FITC标记的CD45抗体（最终浓度的细胞悬浮液的5微克/毫升，稀释因子1：100），在4℃在黑暗中20分钟。 反向填补用200μl的FC缓冲器的计数管没有任何洗涤步骤，并直接记录的CD45 +细胞中的流式细胞仪。 8.流式细胞仪采集注意：要分析所提出的抗体面板，适当的流式细胞仪已经被配备有蓝色（488纳米），红色（635纳米），紫（405纳米）的激光和过滤器的FITC，PE，PerCP经Cy5.5，PECy7， APC-Cy7的和AmCyan。 通过使用未染色细胞从局部缺血半球调整向前（FSC）和侧向（SSC）分散。区分从单个细胞双峰中示出的FSC的面积和高度的点图。 显示在单参数柱状图所有的单细胞使用的每个荧光通道，调整光电倍增管（PMT）电压，使单个细胞显示在最左边的直方图。 使用CD45-FITC单染色样品通过在每个直方图和散射图backgating CD45 高免疫细胞以检查感兴趣的细胞分散和PMT设置。注意：适应的FITC的PMT电压，使得CD45阴性，中间体（int）和高表达细胞能够彼此区别开来。 用抗体捕获补偿珠进行多色彩补偿。设置闸门为小胶质细胞（CD45 int）和白细胞（CD45 高 ），并随后根据图 1中所显示的选通策略定义白细胞亚群。