Этот протокол представляет собой метод для выполнения количественного, для одной ячейки в месте анализа экспрессии белка изучать спецификации клонов у мышей преимплантационных эмбрионов. Процедуры, необходимые для сбора бластоцисты, вся монтажа обнаружение Иммунофлуоресцентной белков, томография образцов на конфокальной микроскопии и ядерного сегментации и анализа изображений описаны.
Этот протокол представляет собой способ для выполнения количественной, одноклеточный на месте анализов экспрессии белка изучать спецификации клонов в мышиных эмбрионов предимплантационной. Процедуры, необходимые для получения эмбрионов, иммунофлюоресценции, визуализации на конфокальной микроскопии и сегментации изображений и анализа описаны. Этот метод позволяет количественное определение экспрессии нескольких ядерных маркеров и пространственные (XYZ) координаты всех клеток в эмбрионе. Он использует минут, при этом изображения инструмента сегментации программное обеспечение, специально разработанной для анализа конфокальных изображений преимплантационных эмбрионов и эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) колоний. MINS осуществляет неконтролируемый ядерный сегментацию через X, Y и Z размеры, и производит информацию о положении клеток в трехмерном пространстве, а также уровень ядерные флуоресценции для всех каналов с минимальным пользовательского ввода. Хотя этот протокол был оптимизирован для анализа изображенийиз предимплантационной эмбрионов этап мыши, он может быть легко адаптированы к анализу любых других образцов, обладающих хорошим соотношением сигнал-шум и где высокая плотность ядер представляет препятствие для сегментации изображений (например., выражение анализ эмбриональных стволовых клеток (ЭСК ) колонии, дифференцируя клеток в культуре, эмбрионы других видов или стадий, и т.д.).
Мыши предимплантационной эмбрионов является парадигмой для изучения возникновения и поддержания плюрипотентности в естественных условиях, а также модели для изучения спецификации клеточных судеб и De Novo эпителизации у млекопитающих. В предимплантационная этапы развития млекопитающих посвящены созданию трех клеточных линий, которые составляют бластоцисты, а именно плюрипотентных эпибласте – что приводит к большинству соматических тканей и зародышевых клеток – и двух внеэмбриональные родах, то трофэктодерме (ТЕ) и примитивный эндодермы (предварительно) (1А) 1,2. Этот протокол описывает процедуры (1) эмбрионов урожай и исправить предимплантационной стадии мыши, (2) выполняет иммунофлюоресценции маркировать белки, представляющие интерес, (3) осуществляют весь монтажа изображений с помощью конфокальной микроскопии с Z-секционирования возможностей и (4) выполнить ядерной сегментацию конфокальных изображений и анализирует последующее количественное изображение. Этот трубопровод позволяет тон Несмещенные измерение уровней белка для присвоения клеточных идентичностей охарактеризовать субпопуляции клеток на месте. Этот протокол может быть осуществлена в качестве лишь 3 – 4 дней в течение одного помета (как правило, до 10 эмбрионов мыши), из коллекции эмбриона к анализу данных (Фиг.1В). Одновременный анализ нескольких пометов приведет к увеличению изображения и анализа данных в реальном времени бремя, таким образом, расширяя общую длину протокола.
Эмбрион предимплантационной стадии мышь экспериментально сговорчивым система, которая, учитывая ее небольшие размеры и стереотипное морфология 3, хорошо подходит для в целом визуализации клеточных процессов с разрешением одноклеточного. Для того чтобы осуществить объективную, системы уровня анализа статистически соответствующее количество эмбрионов, автоматизированная, количественный анализ трубопровода желательно. Тем не менее, из-за высокой плотности ядер массы внутренней клеточной (ICM) бластоцисты ( <stRong> 1А, 2D), обычные сегментация изображения платформы не в состоянии обеспечить достаточную точность, чтобы установить автоматизированную или полуавтоматическую рабочий процесс. С другой стороны, руководство сегментации, в то время как точные, не позволяет обрабатывать большие когорты клеток и эмбрионов, а также не подходит для воспроизводимой, беспристрастной определения клеточных идентичностей – что особенно важно при изучении стадий развития, где формы маркера выражение не полностью решены (например, не проявляют бинарный дистрибутив через населением). Недавно мы разработали и утверждена метод сегментации изображений специально для мыши преимплантационных эмбрионов стадии и мышиных эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), что обеспечивает высокую точность, но требует ввода минимальные пользователя 4-8.
Трубопровод анализ, представленный здесь вращается вокруг MATLAB основе инструмента сегментации изображения Модульная Интерактивная ядерной сегментации (МИН) 4. MINS рerforms неконтролируемого ядерного сегментацию на больших партий конфокальной Z-стеки после того как пользователь установил минимальное количество свойств изображения, используя графический пользовательский интерфейс (GUI) (таблица 1) 4. Этот трубопровод доказала эффективность для генерации данных с высокой пропускной способностью на экспрессии белка и локализации клеток в обоих дикого типа, экспериментально обрабатывают и генетически модифицированные эмбрионы и стволовые клетки 5-7. В настоящем протоколе, мы опишем применение минут до сегментации зародыша изображений предимплантационной стадии. Примеры исполнения минут на ESCs см до 4,7. Автоматизированная шаг ядерная сегментация позволяет значительно сократить время трудоемкости процесса идентификации ячейки, в то время как пространственные и флуоресценции измерений интенсивности позволит объективную определение клеточных идентичностей и генерацию трехмерных карт экспрессии генов доменов и положение клеток в эмбрионе (рис 1С </strong>). Кроме того, масштабируемость этого процесса делает его применимым к анализу отдельных пометов через многочисленные группы экспериментально обработанных эмбрионов или эмбрионов различных генетических фонов 5,6. MINS находится в свободном доступе на http://katlab-tools.org (программное обеспечение требует лицензии MATLAB).
Нет подход, разработанный на сегодняшний день не позволяет генерировать такие данные углубленных на экспрессию белка и локализации клеток в мышь преимплантационных эмбрионов. Все попытки до сих пор в количественном эти типы данных были ограничены в ручном определения и количественного числа клеток для различных групп населения в зародыше (либо полностью вручную, либо программного обеспечения при содействии) 9-19. Этот подход (включающий программное обеспечение мин) был специально для и протестирован на мышиных эмбрионов и предимплантационной ESCs; Тем не менее его производительность на других системах с высокой плотностью ядерной, хотя еще не проверялось, как ожидается, будет эквивалентна.
Настоящий Протокол описывает метод для выполнения количественного анализа целом монтажа иммунофлуоресценции на предимплантационной эмбрионов этап мыши. Надежный протокол 22 иммунофлюоресценции следует высоким разрешением, целый монтажа конфокальной микроскопии и сегментаци…
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Stefano Di Talia, Alberto Puliafito, Venkatraman Seshan and Panagiotis Xenopoulos, for input on data handling, analysis and representation, Berenika Plusa for assistance in the design of the immunofluorescence protocol and antibody testing and members of the Hadjantonakis lab for comments on the manuscript and on the development of this protocol. Work in our lab is supported by the National Institutes of Health R01-HD052115 and R01-DK084391, and by NYSTEM N13G-236.
Embryo collection | |||
Blunt probe for plug checking | Roboz | RS-9580 | |
Forceps | Roboz | RS-4978 | |
Surgery scissors | Roboz | RS-5910 | |
Glass Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-20C | |
Pre-assembled aspirator tube & mouthpiece | Sigma | A5177 | |
Longer rubber tubing | Fisher | 14-178-2AA | |
M2 | Millipore | MR-015-D | |
FHM | Millipore | MR-024-D | |
Acid Tyrode's solution | Millipore | MR-004-D | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | |
4-well plates | Nunc/Thermo-Fisher | 12-566-300 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Immunofluorescence | |||
96-well U-bottom plates | Fisher | 14-245-73 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
Glycine | Sigma | G7403 | |
Horse serum | Sigma | H0146 | |
Primary antibodies | Concentration | ||
CDX2 | Biogenex | AM392-5M | 1:200 |
GATA6 | R&D | AF1700 | 1:100 |
GATA4 | Santa Cruz | sc-9053 | 1:100, 10 min fixation |
GATA4 | Santa Cruz | sc-1237 | 1:100, overnight fixation |
SOX17 | R&D | AF1924 | 1:100 |
Nanog | ReproCELL | RCAB0002P-F | 1:500 |
OCT4 | Santa Cruz | sc-5279 | 1:100, 10 min to overnight fixation |
DAB2 | BD | BD-610464 | 1:200 |
Secondary antibodies | Life Technologies | Various | 1:500 |
Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Imaging | |||
35 mm glass-bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Segmentation | |||
Computer running 64-bit Windows OS | n/a | Verify minimal system requirements at http://katlab-tools.org and in Lou et al., (2014) Stem Cell Reports | |
MATLAB (software) | Mathworks | n/a | |
MINS (software) | Free | n/a | http://katlab-tools.org |