Kwantitatieve Analyse van eiwitexpressie aan Lineage Specificatie studie in muizenmodellen preimplantatie embryo's

De muis pre-implantatie embryo een paradigma voor het ontstaan ​​en behoud van pluripotentie in vivo, evenals als model voor de studie die het lot specificatie en de novo epithelialisatie bij zoogdieren te bestuderen. De pre-implantatie stadia van de ontwikkeling van zoogdieren zijn toegewijd aan de oprichting van de drie cellijnen die deel uitmaken van de blastocyst, namelijk de pluripotente epiblast – en twee extra-embryonale lijnen, de trophectoderm (TE) en de – die heeft geleid tot de meeste somatische weefsels en kiemcellen geeft primitieve endoderm (pre) (Figuur 1A) ^1,2. Dit protocol beschrijft de procedures om (1) de oogst en bevestig pre-implantatie stadium muizenembryo's, (2) het uitvoeren van immunofluorescentie om eiwitten van belang te labelen, (3) verrichten whole-mount beeldvorming met behulp van een confocale microscoop met-z snijden mogelijkheden en (4) het uitvoeren van nucleaire segmentatie van confocale beelden en de daarop volgende beeld kwantitatieve analyses. Deze leiding maakt tHij onpartijdige meting van eiwitniveaus voor toewijzing van cel identiteiten subpopulaties van cellen in situ karakteriseren. 4 dagen om de data-analyse (Figuur 1B) voor één nest (doorgaans tot 10 muizenembryo's), van embryo – Dit protocol kan in slechts 3 worden uitgevoerd. De gelijktijdige analyse van een aantal nesten zou de beeldvorming en data-analyse tijd last te verhogen, waardoor de totale lengte van het Protocol tot verlenging.

De pre-implantatie stadium muizenembryo is een experimenteel handelbaar systeem dat, gezien de geringe omvang en stereotiepe morfologie ^3, is zeer geschikt voor in toto beeldvorming van cellulaire processen met single-cell resolutie. Om een ​​onbevooroordeelde, systems-niveau analyse van een statistisch relevant aantal embryo's uit te voeren, een geautomatiseerde, kwantitatieve analyse pipeline is wenselijk. Echter, vanwege de hoge nucleaire dichtheid van de binnenste celmassa (ICM) van de blastocyst ( <strong> Figuur 1A, 2D), conventionele image segmentatie platforms niet aan voldoende nauwkeurigheid om een geautomatiseerde of semi-geautomatiseerde workflow vestigen. Anderzijds, handmatige segmentatie nauwkeurig, maar niet de verwerking van grote cohorten van cellen en embryo toelaten, noch is het geschikt om reproduceerbare onpartijdige bepaling van cel identiteiten – wat vooral van belang bij de studie ontwikkelingsstadia waar het patroon van marker meningsuiting nog niet volledig opgelost (bijvoorbeeld, doe een binaire verdeling over een populatie vertonen). We hebben onlangs ontwikkeld en gevalideerd een beeld segmentatie methode op maat gemaakt voor de muis pre-implantatie embryo's en muis embryonale stamcellen (SER), die een hoge nauwkeurigheid bereikt, terwijl die een minimale input van de gebruiker ^4-8.

De analyse pipeline hier gepresenteerde draait om de MATLAB-gebaseerde beeld segmentatietool Modular Interactive Nuclear Segmentation (minuten) ^4. MINS performs onbewaakte nucleaire segmentatie op grote hoeveelheden confocale Z-stacks nadat de gebruiker zo min mogelijk beeld eigenschappen heeft vastgesteld met behulp van een grafische gebruikersinterface (GUI) (Tabel 1) ^4. Deze pijplijn is efficiënt gebleken voor het genereren van hoge doorvoer gegevens eiwitexpressie en cellen lokalisatie in zowel wildtype experimenteel behandelde en genetisch gemodificeerde embryo en SER ^5-7. In het huidige protocol beschrijven we de toepassing van minuten naar de segmentatie van pre-implantatie-embryo stadium beelden. Voor voorbeelden van MINS prestaties op sociaal-economische raden verwijzen wij u naar ^4,7. De geautomatiseerde nucleaire segmentatie stap vermindert de tijd last van de cel identificatieproces, terwijl de ruimtelijke en fluorescentie-intensiteit metingen laten een onbevooroordeelde bepaling van cel identiteiten en het genereren van driedimensionale kaarten van genexpressie domeinen en celpositie in het embryo (Figuur 1C </strong>). Bovendien is de schaalbaarheid van deze werkstroom maakt het voor die analyse van afzonderlijke nesten door grote cohorten van experimenteel behandelde embryo of embryo's van verschillende genetische achtergronden ^5,6. MINS is vrij beschikbaar op http://katlab-tools.org (de software vereist een MATLAB-licentie).

Geen aanpak ontwikkeld tot op heden staat de vorming van dergelijke diepgaande gegevens over eiwit expressie en cel lokalisatie in de muis pre-implantatie embryo's. Alle pogingen tot nu toe bij het ​​kwantificeren van dit soort gegevens zijn beperkt tot het handmatig bepalen en kwantificering van de mobiele nummers voor verschillende populaties in het embryo (hetzij geheel handmatig of software-geassisteerde) ^9-19. Deze benadering (integratie van MINS software) is op maat gemaakt voor en getest op de muis pre-implantatie embryo's en SER; niettemin zijn prestaties op andere systemen met hoge dichtheid nucleaire, hoewel nog niet getest, wordt verwacht gelijkwaardig.