जापानी बटेर भ्रूण की जर्दी थैली झिल्ली से प्राथमिक endodermal उपकला सेल संस्कृति
Summary
To study the mechanism of lipid utilization in yolk sac membranes during the late stages of avian embryonic development, we established a primary Japanese quail embryonic endodermal epithelial cell culture system.
Abstract
हम विकास के दौरान एवियन भ्रूण से पोषक तत्व उपयोग मध्यस्थता में कुछ एंजाइमों और प्रोटीन के समारोह के अध्ययन के लिए एक endodermal उपकला सेल संस्कृति मॉडल (ईईसी) की स्थापना की। निषेचित जापानी बटेर अंडे 5 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर incubated रहे थे और फिर जर्दी थैली झिल्ली (वाईएसएम) ईईसी संस्कृति प्रणाली स्थापित करने के लिए एकत्र किए गए थे। हम वाईएसएम से भ्रूण एण्डोडर्म परत अलग-थलग, और 2 में झिल्ली कटा हुआ – 3 मिमी टुकड़े और आंशिक रूप से 24 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों में बोने से पहले कोलैजिनेज़ के साथ पचा। EECS ऊतक से बाहर पैदा करना और सेल संस्कृति के अध्ययन के लिए तैयार हैं। हमने पाया है कि EECS उदाहरण के लिए विवो में वाईएसएम के विशिष्ट विशेषताओं, लिपिड बूंदों का संचय, sterol हे acyltransferase और लिपोप्रोटीन lipase की अभिव्यक्ति थी। आंशिक पाचन उपचार काफी ईईसी संस्कृति के सफल दर में वृद्धि हुई। EECS का उपयोग, हम दिखा दिया है कि SOAT1 की अभिव्यक्ति द्वारा शिविर डी विनियमित किया गया थाependent प्रोटीन इससे संबंधित एक मार्ग kinase। इस प्राथमिक जापानी बटेर ईईसी संस्कृति प्रणाली भ्रूण लिपिड परिवहन अध्ययन करने के लिए और एवियन भ्रूण के विकास के दौरान वाईएसएम में पोषक तत्वों के उपयोग में मध्यस्थता में शामिल जीन की भूमिका स्पष्ट करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है।
Introduction
एवियन भ्रूण के प्रमुख पोषण संसाधन की जर्दी, 33% लिपिड, 17% प्रोटीन से बना है, और 1% राख। 1 भ्रूण के विकास के दौरान, जर्दी थैली झिल्ली (वाईएसएम) भ्रूण उदर गुहा के भीतर से बढ़ता है और धीरे-धीरे जर्दी को शामिल किया सतह। भ्रूण दिन 2 में शुरू हुए जीन लिपिड चयापचय और angiogenesis के साथ जुड़े अभिव्यक्ति धीरे-धीरे वाईएसएम में वृद्धि हुई है, और धीरे-धीरे वाईएसएम अंकुर अनुमानों की तरह विकसित करता है। 8,9 इन अनुमानों भ्रूण के विकास का समर्थन करने के लिए जर्दी पोषक तत्वों के अवशोषण में वृद्धि। वाईएसएम एक extraembryonic ऊतक कि तीन रोगाणु परतों, endoderm, mesoderm और बाह्य त्वक स्तर होता है। 14 जर्दी थैली बाह्य त्वक स्तर पीतक झिल्ली धीरे जर्दी थैली को कवर करने के साथ अंडे की सफ़ेदी और लिंक चेहरे। Endodermal उपकला कोशिकाओं अंडे की जर्दी की ओर सीधे सामना करना पड़ा और पोषक तत्व उपयोग पोर्टल के रूप में endodermal उपकला सेल (EECS) सेवा करते हैं। 6 वाईएसएम फैलता है, कर रहे हैं shap से विभाजित किया जा सकता हैई और दो समूहों, क्षेत्र पीतक और क्षेत्र vasculosa में कार्यक्षमता। 7
क्षेत्र पीतक endodermal कोशिकाओं से बना है और भ्रूण से दूर है; क्षेत्र vasculosa mesodermal कोशिकाओं से बना है और रक्त वाहिकाओं और संयोजी ऊतक के साथ भेदभाव EECS शामिल किया गया है। भ्रूण दिन 5, जर्दी पूरी तरह से बाहरी झिल्ली और वाईएसएम के एण्डोडर्म द्वारा कवर किया जाता है और नाड़ी क्षेत्र तेजी से बढ़ा है। वाईएसएम अवशोषित कर लेता है, recomposes और रिलीज लिपिड (के रूप में की जर्दी व्युत्पन्न बहुत कम घनत्व वाले लिपोप्रोटीन) और प्रोटीन भ्रूण संचार प्रणाली में। 9, 2 इसलिए, हम एक प्राथमिक जापानी बटेर भ्रूण endodermal उपकला सेल संस्कृति प्रणाली की स्थापना की, लिपिड के तंत्र का अध्ययन करने के लिए एवियन भ्रूण के विकास के दौरान वाईएसएम में उपयोग।
ऐसे triacylglycerol, लेसिथिन, फॉस्फोलिपिड और कोलेस्ट्रॉल एस्टर (सीई) के रूप में लिपिड एवियन भ्रूण के लिए प्राथमिक ऊर्जा स्रोत हैं। विकास के प्रारंभिक दौर में, जर्दी लिपिड ग रहे हैंकेवल 1.3% सीई की omposed और यह एवियन भ्रूण के विकास के 3 के मध्य अवधि में 10-15% तक बढ़ जाता है, 11। कोलेस्ट्रॉल एस्टर एवियन भ्रूण वाईएसएम में sterol हे acyltransferase 1 (SOAT1) द्वारा कोलेस्ट्रॉल से संश्लेषित है। 4
कोलेस्ट्रॉल के भंडारण के रूप हैच से पहले वहाँ एवियन भ्रूण का तेजी से विकास एक सप्ताह सीई, सीई लिपो प्रोटीन में किया जाता है, और लिपो प्रोटीन ऊतकों को प्रचलन से ले जाया जाता है। 13। लगभग जर्दी में शेष लिपिड सामग्री के 68% इस चरण के दौरान अवशोषित कर रहे हैं। 10 व्यवस्था है जिसके द्वारा जर्दी लिपिड उपयोग किया जाता है एक ईईसी अनुसंधान मॉडल के आधार पर स्पष्ट किया जा सकता है। एक चिकन ईईसी संस्कृति प्रोटोकॉल ऊतक explants की सफलता दर कम, एक बेहतर ईईसी सेल संस्कृति प्रक्रिया से पोषक तत्व उपयोग मध्यस्थता में कुछ एंजाइमों और प्रोटीन के समारोह का अध्ययन करने की जरूरत है के कारण इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए अनुसंधान स्थापना की थी। 2, 9 हालांकि, विकास के दौरान एवियन भ्रूण।
Protocol
Representative Results
Discussion
क्योंकि पिछले संस्कृति प्रणाली केवल सीमित सफलता है, एक बेहतर संस्कृति प्रणाली की जरूरत है। जापानी बटेर वाईएसएम एण्डोडर्म ऐसे कोलैजिनेज़ पूर्व vivo explants में बेहतर विकास के प्रदर्शन को प्राप्त करने सेल स?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
वर्तमान प्रोटोकॉल के विकास के लिए अनुदान विशेष रूप से नेशनल ताइवान विश्वविद्यालय, ताइवान के (अनुदान आईडी 104R350144), साथ ही विज्ञान और ताइवान की प्रौद्योगिकी मंत्रालय (अनुदान आईडी "शीर्ष विश्वविद्यालय योजना के लिए उद्देश्य" द्वारा समर्थित है: मोस्ट 104 -2,313-B-002-039-MY3)। हम विशेष रूप से वर्तमान अध्ययन के लिए एक जानवर कक्ष और प्रयोगशाला अंतरिक्ष प्रदान करने के लिए नेशनल ताइवान विश्वविद्यालय के जैव प्रौद्योगिकी के लिए केंद्र धन्यवाद।
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco by Life technologies | 12800-017 10 X 1 L | For wash the EECs pellets |
| D-MEM/F-12 | Gibco by Life technologies | 12400-024 10 X 1 L | As the basal medium in culturing EECs |
| NBCS | Gibco by Life technologies | 16010-159 | As the supplyment serum in culturing EECs |
| Pen-Strep Ampho. Solution | BI (Biological Industries) | 03-033-1B 100ml | For attenuating the possible infection |
| Collagenase Type IV | Gibco by Life technologies | 17104-019 1g | Collagenase is a protease with specificity for the bond between a neutral amino acid (X) and glycine in the sequence Pro-XGly-Pro. As the protease for dissociation of cells from primary tissue. |
| 24 well plate | FALCON® | REF-353047 | For EECs to attach and extension |
| 50 ML PP centrifuge tubes | Corning® CentriStarTM | 430829 | For transportion of membranes and enzyme digestion |
| 50ML Conical bottomed Tube with Cap | PRO TECH | CT-50-PL-TW | For transportion of membranes and enzyme digestion |
| Reciprocal shaking bath | DEAGLE | SB302 | For better enzymatic digestion on membranes |
References
- Abeyrathne, E. D., Lee, H. Y., Ahn, D. U. Egg white proteins and their potential use in food processing or as nutraceutical and pharmaceutical agents–a review. Poult Sci. 92 (12), 3292-3299 (2013).
- Bauer, R., Plieschnig, J. A., Finkes, T., Riegler, B., Hermann, M., Schneider, W. J. The developing chicken yolk sac acquires nutrient transport competence by an orchestrated differentiation process of its endodermal epithelial cells. J Biol Chem. 288 (2), 1088-1098 (2013).
- Ding, S. T., Nestor, K. E., Lilburn, M. S. The concentration of different lipid classes during late embryonic development in a randombred turkey population and a subline selected for increased body weight at sixteen weeks of age. Poult Sci. 74 (2), 374-382 (1995).
- Ding, S. T., Lilburn, M. S. The developmental expression of acyl-coenzyme A: cholesterol acyltransferase in the yolk sac membrane, liver, and intestine of developing embryos and posthatch turkeys. Poult Sci. 79 (10), 1460-1464 (2000).
- Ding, S. T., Lilburn, M. S. The ontogeny of fatty acid-binding protein in turkey (Meleagridis gallopavo) intestine and yolk sac membrane during embryonic and early posthatch development. Poult Sci. 81 (7), 1065-1070 (2002).
- Kanai, M., Soji, T., Sugawara, E., Watari, N., Oguchi, H., Matsubara, M., Herbert, D. C. Participation of endodermal epithelial cells on the synthesis of plasma LDL and HDL in the chick yolk sac. Microsc Res Tech. 35 (4), 340-348 (1996).
- Mobbs, I. G., McMillan, D. B. Structure of the endodermal epithelium of the chick yolk sac during early stages of development. Am J Anat. 155 (3), 287-309 (1979).
- Mobbs, I. G., McMillan, D. B. Transport across endodermal cells of the chick yolk sac during early stages of development. Am J Anat. 160 (3), 285-308 (1981).
- Nakazawa, F., Alev, C., Jakt, L. M., Sheng, G. Yolk sac endoderm is the major source of serum proteins and lipids and is involved in the regulation of vascular integrity in early chick development. Dev Dyn. 240 (8), 2002-2010 (2011).
- Noble, R. C., Cocchi, M. Lipid metabolism and the neonatal chicken. Prog Lipid Res. 29 (2), 107-140 (1990).
- Shand, J. H., West, D. W., McCartney, R. J., Noble, R. C., Speake, B. K. The esterification of cholesterol in the yolk sac membrane of the chick embryo. Lipids. 28 (7), 621-625 (1993).
- Speier, J. S., Yadgary, L., Uni, Z., Wong, E. A. Gene expression of nutrient transporters and digestive enzymes in the yolk sac membrane and small intestine of the developing embryonic chick. Poult Sci. 91 (8), 1941-1949 (2012).
- Walzem, R. L., Hansen, R. J., Williams, D. L., Hamilton, R. L. Estrogen Induction of VLDLy Assembly in Egg-Laying Hens. J Nutr. 129 (2), 467S-472S (1999).
- Yoshizaki, N., Soga, M., Ito, Y., Mao, K. M., Sultana, F., Yonezawa, S. Two-step consumption of yolk granules during the development of quail embryos. Dev Growth Differ. 46 (3), 229-238 (2004).
- . . alamarBlue Cell Viability Assay Protocol. , (2008).
- Lin, H. Y., Chen, C. C., Chen, Y. J., Lin, Y. Y., Mersmann, H. J., Ding, S. T. Enhanced Amelioration of High-Fat Diet-Induced Fatty Liver by Docosahexaenoic Acid and Lysine Supplementations. Biomed Res Int. 2014 (1), 310981 (2014).
- Lin, Y. Y., et al. Adiponectin receptor 1 regulates bone formation and osteoblast differentiation by GSK-3β/β-Catenin signaling in mice. Bone. 64, 147-154 (2014).
