Eine Duplex-Digital-PCR-Assay für Simultaneous Quantifizierung der<em> Enterococcus spp.</em> Und das menschliche Fecal-assoziierte HF183 Marker in Waters
Summary
Diese Handschrift beschreibt eine Duplex digitalen PCR Assay , die gleichzeitig verwendet werden können , um Enterococcus spp quantifizieren. Und die HF183 genetischen Markern als Indikatoren für allgemeine und menschlichen assoziiertes fäkale Verunreinigung in Erholungsgewässern.
Abstract
Dieses Manuskript beschreibt eine Duplex – Digital – PCR – Assays (EntHF183 dPCR) für die simultane Quantifizierung von Enterococcus spp. Und dem menschlichen HF183 Marker fäkal-assoziiert. Die EntHF183 Duplex dPCR (bezeichnet als EntHF183 dPCR hereon) Test verwendet die gleichen Primer und Sonden-Sequenzen wie die veröffentlichten Einzel quantitative PCR (qPCR) Pendants. Ebenso wie die gleichen Wasserfiltration und DNA-Extraktionsverfahren vor der qPCR durchgeführt werden, bevor anschließend dPCR zu laufen. Jedoch hat der duplex dPCR Assay mehrere Vorteile gegenüber den qPCR-Assays. Am wichtigsten ist, beseitigt die dPCR Assay die Notwendigkeit für eine Standardkurve ausgeführt wird und somit die zugeordnete Bias und Variabilität, durch direkte Quantifizierung ihrer Ziele. Darüber hinaus, während Duplexing (dh simultane Quantifizierung) Enterococcus und HF183 in qPCR führt oft zu schweren Unterschätzung der weniger reichlich Ziel in einer Probe stellt dPCR konsistente Quantifizierung beider Ziele, wetzensie einzeln oder gleichzeitig in dem gleichen Reaktions quantifiziert. Der dPCR Assay ist auch in der Lage PCR Inhibitorkonzentrationen zu tolerieren, 1.59 Grßenordnungen höher sind als diejenigen, die durch qPCR toleriert. Diese Vorteile machen die EntHF183 dPCR Test besonders attraktiv, weil es bietet gleichzeitig präzise und wiederholbare Informationen über allgemeine und Mensch-assoziierte fäkale Verunreinigungen in Umwelt Gewässern ohne die Notwendigkeit zwei getrennte qPCR-Assays auszuführen. Trotz seiner Vorteile gegenüber qPCR, wobei der obere Bestimmungsgrenze des dPCR Assay mit derzeit verfügbaren Instrumentierung ist ungefähr vier Größenordnungen niedriger als die erzielbaren qPCR. Folglich wird Verdünnung für die Messung hoher Konzentrationen von Zielorganismen erforderlich, wie sie typischerweise folgende Abwasser Verschüttungen beobachtet.
Introduction
Quantitative PCR (qPCR) Verfahren wurden für die Freizeit-Überwachung der Wasserqualität und mikrobiellen Quelle Tracking-Anwendungen weit verbreitet, weil sie schneller sind, flexibler und spezifischer im Vergleich zu traditionellen Kultur-basierten Methoden. Folglich wird qPCR für die Erzielung eines raschen Wasserüberwachungsergebnisse für die allgemeine fäkale Indikatoren wie Enterococcus spp empfohlen. In den überarbeiteten USEPA Erholungswasserqualitätskriterien 1. Viele qPCR – Assays wurden auch zur Identifizierung von Quellen von fäkale Verunreinigungen in Umwelt Gewässer 2 entwickelt und validiert. Unter diesen sind die HF183 Marker – Assays unter den am häufigsten verwendeten zur Identifizierung von Menschen assoziiert fäkale Verunreinigung 3.
Jedoch kann qPCR Ergebnisse oft vorgespannt werden, da sie auf Standardkurven für die Quantifizierung verlassen. qPCR quantifiziert unbekannten Konzentrationen von Ziel in Proben, die durch ihre Quantifizierung Zyklus Interpolation (CQ) von einem standard Kurve, die eine lineare Beziehung zwischen Cq und logarithmische Menge einer Gruppe von seriell verdünnten Standards beschrieben. Der Mangel an zuverlässigen und konsistenten Standardreferenzmaterial kann daher vorspannen stark qPCR Ergebnisse. Studien zeigten , dass qPCR Ergebnisse um etwa die Hälfte ein Protokoll unter Verwendung von Standards von verschiedenen Anbietern unterschiedlich 4 und durch 2-fach verschiedenen Chargen von Standards vom gleichen Hersteller 5 verwenden.
Digital PCR (dPCR) -Technologie quantifiziert eine unbekannte Probe durch die Frequenz von Positiven in eine große Anzahl von Miniatur – PCRs zählen , die 6 durch Partitionieren eines bulk qPCR in Tausende oder Millionen von gleichförmigen Nanoliter oder Pikoliter – Reaktionen erzeugt werden. Es wird als Tröpfchen digital PCR (dh in diesem Artikel) oder Kammer digitalen PCR jeweils bezeichnet, wenn die Trennwände Wasser-in-Öl – Tröpfchen (dh in diesem Artikel) oder kleine Kammern auf einem Chip sind. Eine höhere Probenkonzentration wird in Anwesenheit von Ziel-DNA führen(Daher positive PCR) in einem höheren Anteil von Trennwänden, eine Beziehung, die durch Poisson-Verteilung angenähert. Als solche sind die binären Ergebnisse (positive oder negative PCR) erfasst und die Frequenz der positiven Tröpfchen verwendet wird unbekannten Probenkonzentrationen direkt über Poisson Approximation zu berechnen, wodurch die Notwendigkeit für eine Standardkurve wie in qPCR eliminieren.
Diese binäre Art der digitalen PCR Quantifizierung bietet zusätzliche Vorteile gegenüber qPCR 7. Da verzögerte Verstärkung noch eine positive PCR ergeben können, ist dPCR Quantifizierung robuster gegenüber Hemmung, die Verstärkungseffizienz verringert. In ähnlicher Weise wird dPCR Quantifizierung nicht durch Variabilität in Cq – Werte betroffen wie qPCR ist, zu einer höheren Genauigkeit der dPCR führt im Vergleich zu qPCR 8-10.
Darüber hinaus gewährleistet das Unterteilungsprozesses eine sehr kleine Menge an Ziel-DNA in jedem Tröpfchen, Substrat Wettbewerb effektiv minimiert wird (während amplification der verschiedenen DNA – Targets), die gemeinsame Hindernisse für Duplex- zu erreichen (dh ein Test misst gleichzeitig zwei DNA – Targets) in qPCR. Als solches ob Lauf im Duplex- oder Simplex (dh ein Ziel in einem einzigen Assay gemessen wird) dPCR produziert fast nicht zu unterscheiden Quantifizierung beider Ziele 7,11.
Das Ziel des digitalen PCR – Assay (EntHF183 dPCR) in diesem Artikel beschriebene gleichzeitige direkte Quantifizierung der allgemeinen fäkale Indikator Enterococcus spp zu erhalten. Und die human-fäkale assoziiert HF183 Marker mit verbesserter Genauigkeit, Reproduzierbarkeit und Robustheit gegenüber Hemmung im Vergleich zu seiner qPCR Pendants. Dieser Assay wurde zur Quantifizierung der fäkalen Kontamination in Umwelt Süßwasser, Meerwasser, und verschiedene Fäkalmaterial 7, kann aber auch angewendet werden auf andere Arten von Gewässern und Abwässern eingesetzt. Dieser Test ist sehr vielversprechend für Sedimente oder Böden aufgrund seiner Analyses eine hohe Toleranz gegenüber der Hemmung, aber weitere Tests wegen Komplexitäten erforderlich Inhibitor in diesen Arten von Proben vermischt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es gibt einige wichtige Schritte in dem Protokoll. Erstens kann der Testgemische Mischen schwierig sein, da der Master-Mix mehr viskos ist als herkömmliche qPCR Master Mixes. Einfache Vortexen kann zu einer unzureichenden Durchmischung führen, was wiederum zu einer ungleichmäßigen Verteilung von DNA-Matrizen in den Testgemischen und anschließend in den Tröpfchen. Die Misch-by-Pipettiertechnik in dem beschriebenen Protokoll müssen befolgt werden, um genaue dPCR Quantifizierung zu gewährleisten. Zweitens ist es wi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| Low Bind Microtubes | Costar | 3207 | For storage of reagents, samples/production of master mixes |
| Nuclease Free Water | FisherSci | BP2484-50 | |
| TE pH 8 buffer | FisherSci | BP2473-100 | |
| Hardshell 96 Well Plate | BioRad | HSP-9601 | For initial master mix and sample inoculation |
| Aluminum Sealing Film | BioRad | 359-0133 | To seal sample plate |
| Droplet Generator | BioRad | 186-3002 | |
| Droplet Generation Oil | BioRad | 186-3005 | |
| Cartridge | BioRad | 186-4008 | |
| DG8 Cartridge Holder | BioRad | 186-3051 | |
| Gasket | BioRad | 186-3009 | |
| 20uL pipet tips | Rainin | GP-L10F | For tansferring sample/master mix to cartidge |
| 200uL pipet tips | Rainin | GP-L200F | For transferring droplets to final Twin.Tec Plate |
| Twin.Tec 96 Well Plate | Eppendorf | 951020320 | For final droplets thermal cycling and reading |
| Pierceable Heat Seal Foil | BioRad | 181-4040 | To seal Twin.Tec plate before thermalcycling |
| PX1 PCR Plate Sealer | BioRad | 181-4000 | Only the thermal cycler is needed, no optics |
| CFX96 Thermalcycler | BioRad | CFX96 and C1000 | |
| QX100 Droplet Reader | BioRad | 186-3001 | |
| Droplet Reader Oil | BioRad | 186-3004 | |
| Droplet PCR Supermix | BioRad | 186-3024 | i.e. the digital PCR mix in manuscript |
| QuantaSoft software (v1.3.2) | Quantasoft | QX100 | For viewing, analyzing, and exporting ddPCR data |
| Entero Forward Primer (Ent F1A) | Operon | GAGAAATTCCAAACGAACTTG | Alternative vendor can be used |
| Entero Reverse Primer (Ent R1) | Operon | CAGTGCTCTACCTCCATCATT | Alternative vendor can be used |
| Entero Probe (GPL813TQ) | Operon | [6-FAM]-TGG TTC TCT CCG AAA TAG CTT TAG GGC TA-[BHQ1] | Alternative vendor can be used, but the florophore has to be FAM |
| HF183 Forward Primer (HF183-1) | Operon | ATCATGAGTTCACATGTCCG | Alternative vendor can be used |
| HF183 Reverse Primer (BthetR1) | Operon | CGTAGGAGTTTGGACCGTGT | Alternative vendor can be used |
| HF183 Probe (BthetP1) | Operon | [6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC ACATTGGA-[BHQ1] |
Alternative vendor can be used, but the florophore has to be HEX (if using VIC, then the appropriate matric compensation must be chosen. |
| Positive control | Mixture of E.faecalius genomic DNA and HF183 standard plasmid (ordered from IDT). For detailed methods in culturing E. faecalius and sequences of the ordered HF183 plasmid, please see Cao et al 2015 (doi:10.1016/j.watres.2014.12.008). Commercilaly available Enterococcus DNA standards (ATCC 29212Q-FZ) can also be used in the positive control in place of lab-prepared E. faecalis genomic DNA. |
References
- Boehm, A. B., et al. Performance of forty-one microbial source tracking methods: A twenty-seven lab evaluation study. Water Res. 47 (18), 6812-6828 (2013).
- Layton, B. A., et al. Performance of human fecal anaerobe-associated PCR-based assays in a multi-laboratory method evaluation study. Water Res. 47 (18), 6897-6908 (2013).
- Cao, Y., et al. Effect of platform, reference material, and quantification model on enumeration of Enterococcus by quantitative PCR methods. Water Res. 47 (1), 233-241 (2013).
- Sivaganesan, M., Siefring, S., Varma, M., Haugland, R. A. MPN estimation of qPCR target sequence recoveries from whole cell calibrator samples. J. Microbiol. Methods. 87 (3), 343-349 (2011).
- Huggett, J. F., et al. The Digital MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments. Clin. Chem. 59 (6), 892-902 (2013).
- Cao, Y., Raith, M. R., Griffith, J. F. Droplet digital PCR for simultaneous quantification of general and human-associated fecal indicators for water quality assessment. Water Res. 70, 337-349 (2015).
- Sanders, R., Huggett, J. F., Bushell, C. A., Cowen, S., Scott, D. J., Foy, C. A. Evaluation of Digital PCR for Absolute DNA Quantification. Anal. Chem. 83 (17), 6474-6484 (2011).
- Whale, A. S., et al. Comparison of microfluidic digital PCR and conventional quantitative PCR for measuring copy number variation. Nucleic Acid Res. 40 (11), 82-89 (2012).
- Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods. 10 (10), 1003-1005 (2013).
- Morisset, D., Štebih, D., Milavec, M., Gruden, K., Žel, J. Quantitative analysis of food and feed aamples with droplet digital PCR. PLoS One. 8 (5), e62583 (2013).
- Cao, Y., et al. Evaluation of molecular community analysis methods for discerning fecal sources and human waste. Water Res. 47 (18), 6862-6872 (2013).
