心筋の構造、機能の in vivo定量的評価では 、灌流および生存率は、心臓マイクロコンピュータ断層撮影法を使用しました

この研究におけるすべての動物作業はエラスムスMC動物研究倫理委員会によって承認されました。実験を通して、動物はエラスムスMC機関の規制に従って維持しました。実験動物の終わりに、吸入麻酔薬イソフルランの過剰投与を使用して安楽死させました。制度上の動物の世話を受け、この作業を開始する前に、委員会の承認を使用してください。 心臓虚血モデルの作製 4％イソフルランの吸入によりマウス（12週齢のC57Bl6を、）麻酔。 20 Gカニューレを用いて動物を挿管し、18センチH 2 Oのピーク吸気圧および4センチH 2 Oの呼気終末陽圧で毎分100回の呼吸でマウスを人工呼吸させます麻酔を維持し、目は麻酔下ながら、眼の乾燥を防ぐために低下し適用するために、2.5％のイソフルランを含むO 2 / N 2（V / V = 1/2）の混合ガスを使用してください。プラ加熱パッド上でマウスをCEおよび手術中、37℃で体温を維持するために直腸体温を測定します。 手術の皮下直前にブプレノルフィン（0.05から0.2ミリグラム/キログラム）を注入し、外科処置の開始前に麻酔の十分な深さを確保するためにつま先ピンチ反射を確認してください。脱毛クリームを使用して、マウスの胸部を脱毛すると、皮膚にヨウ素を適用します。 2番目と3番目の左側の肋骨の間の皮膚でハサミで小さなカットを行うことで、切開を行います。小胸筋とxiphihumeralisの筋肉だけでなく、肋間筋へのアクセスを可能にするために、小さなフックを使用して、サイ​​ドに広背筋を引き出します。 慎重に湾曲した2ミリメートルの板バネのはさみを使用して肺を傷つけることなく第三肋間筋を切断。脇湿ったガーゼの小片を使用して肺を押して、心膜を破裂。 注：左横隔神経を傷つけないように注意してください。 Repositi胸部内側に筋肉を保持し、左心房の左心室（LV）自由壁と一部の大部分が表示されるようにして再配置小さなフックに。 左冠状動脈の下に7-0絹縫合糸を挿入し、しっかりと縫合糸を結びにより動脈を閉塞します。 注：ほとんどのマウスでは、冠状動脈が表示されていないので、アトリウムを使用して、合字の位置を決定し、常に梗塞サイズを標準化するために2ミリメートル左心房のエッジ下の冠状動脈を結紮。 視覚的に左心室自由壁の杭を確認することにより、梗塞の成功誘導のために確認してください。杭が観察されていない場合、LADを閉塞するための追加の試みを行います。 6-0絹縫合糸を使用してしっかりと胸を閉じます。 注：胸が回復した後独立した呼吸を可能にするために気密閉鎖されるべきです。 生理食塩水で傷口をきれいにし、使用して皮膚を閉じます絹縫合糸。創傷治癒を促進し、感染を防止するために、皮膚に創傷スプレーを適用します。 オフイソフルランを回して換気チューブを取り外す前に、それ自体で呼吸する動物開始まで待ちます。回復しつつ加熱パッド上のケージにマウスを置きます。 注：それは腹側横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したまで無人の動物を放置しないでください。完全に回復するまで、他の動物の会社に手術を受けた動物を返さないでください。 術後の鎮痛のための手術後ブプレノルフィンの追加投与量ごとに8-12時間を管理します。腹腔内にブプレノルフィン（50μgの/キログラム）を管理します。 注：ミクロ（第3節）最初のスキャンのための手術後3-4時間と第2の走査のための手術後6-7時間までに動物をスキャンします。 マイクロCTコントラストの2インジェクション 2 successivに、解剖学的機能および代謝の情報を取得するために電子マイクロCTイメージングセッションは、ヨード造影剤を使用しています。 70％のアルコールを使用して、バイアルストッパーのゴムを公開し、扱います。低デッドスペース、注射器を用いて、造影剤の必要量（体重の5〜10μL/ g）を引き出します。いずれの場合前後にプランジャーを前進および/または穏やかに注射器の側面をタップし、流体が先端に表示されるまで、ゆっくりと滅菌吸収性組織内に空気を排出することにより、射出時のパージ空気の泡を塞栓症の危険を防止するために、針。 注：マイクロCTコントラストの注射は、意識的または鎮静させた動物で行うことができます。物理的な拘束は、意識のある動物で実行する必要があります。ストレスを最小限に抑えるために、吸入麻酔システムの光鎮静または一般的なイソフルラン麻酔を検討してください。 注射の前に、70％アルコールで尾を綿棒。ランプまたはより優れた血管拡張を提供するために、温水（40〜45℃）に尾を浸漬することにより尾を温めます。造影剤を注入する私ntravenously（例えば、外側尾静脈のうちの1つを介して）体重の5〜10μL/ gで。 注：コントラスト強調は、研究対象の動物と画像ノイズのレベルの健康や栄養状態に影響され得るように、特定の動物モデルまたはマイクロCT機器の取得設定の注入量を最適化します。 3.マイクロCTイメージングコンピュータの電源ボタンを押して、マイクロCTスキャナの電源を入れ、注射を対比する前に。マイクロCT制御ソフトウェアを起動し、ソフトウェア制御のウィンドウに表示されているウォームアップボタンをクリックすることにより、X線管を温めます。 ライブモードボタンは、ウォームアップが完了したことを示す制御ソフトウェアで表示されるのを許可します。小口径のカバーを挿入し、小動物のベッドを配置します。 画像データが保存され、適切なデータベース、研究、および件名を作成するかを選択します。新しいデータベースを作成するには、データベースウィンドウで新しいデータベース]ボタンをクリックし、データベースが保存されるドライブに移動し、表示されるダイアログボックスで[参照]ボタンをクリックし、新しいデータベースを指定し、[OK]をクリックする名前を入力します。データベースウィンドウで新しいデータベースを確認します。既存のデータベースに接続するには、データベースウィンドウでデータベースのボタンに接続]をクリックし、データベース名をダブルクリックします。 ソフトウェアコントロールウィンドウのドロップダウンメニューから、次のパラメータを選択することにより、スキャン条件設定：X線管電圧、90 kVのを。 CT、X線管電流、160μA。ライブX線管電流、80μA。 FOV、20ミリメートル。ゲーティング技術、心肺;スキャン技術、4.5分。 注：この撮影プロトコルは、拡張末期と収縮末期の3Dデータセットの再構築を可能にし、40ミクロ​​ンの再構成された等方性ボクセルサイズ512×512×512のマトリクスサイズ、各。 造影剤を動物に注入した後、4％イソフルランの吸入により誘導室中で麻酔。空気中の酸素の混合物中に1.5から2.0パーセントイソフルランを供給ノーズコーンとスキャナの動物のベッドの上で動物を置きます。必要に応じて、毎分≤60呼吸と動物の安定した呼吸活性を達成するためにイソフルランの流れを調整します。 安全インターロックを係合するために右にスライドさせることにより、機器のドアを閉じます。リアルタイムに被写体を表示するには、制御ソフトウェアのウィンドウに表示されるライブモード]ボタンをクリックすることで、ライブモードをオンにします。 X-キャプチャウィンドウや動物を観察します。 注：ドアが正しく閉じられ、安全インターロックが締結されない限り、楽器は、X線を発生しません。 前後に、機器の前面パネルにあるボタンをステージZ軸制御を押してビュー（FOV）のフィールド内でマウス胸を整列させるために、動物のベッドを移動します。胸がFOV内の中央にあることを確認します。トンを配置するために、機器の前面パネルにある動物ベッドコントロール左右の矢印を使用します青いバウンディングボックスの内側彼は動物。 制御ソフトウェアのウィンドウに表示される回転制御ドロップダウンリストから「90」を選択し、[設定]ボタンをクリックして、ガントリを回転させます。動物はX-キャプチャウィンドウの青いバウンディングボックス内に留まることを確認してください。必要に応じて、機器の前面パネルにある動物のベッド制御UPとDOWNの矢印を使用して動物を揃えます。 注：X-キャプチャウィンドウに表示される青色のバウンディングボックス内のみの画像データは、3Dボリュームを再構築するために使用されます。 心肺痕跡がはっきりと同期ビューで表示されるようにXcaptureウィンドウで、マウスの左クリックで、マウスカーソルでエッジROIをドラッグして興味（ROI）の心肺領域のサイズを変更します。 ROIは、振動板と、すべてのガントリ位置における心臓の頂端部を覆うことを確認してください。カーディはそれを確認するためにステップ3.6で説明したように、ガントリと90度回転O-呼吸痕跡がまだはっきりと見えます。 注：電離放射線への不必要な曝露を防止するために、動物の位置および心肺ROIが調整される時間を最小限に抑えます。 買収を初期化する制御ソフトウェアのウィンドウに表示されるCTスキャン]ボタンをクリックします。 CTスキャンの確認メッセージが表示されます。確認するために、CTスキャンの確認メッセージに示されているYES]ボタンをクリックします。スキャンを中止するにはNoボタンをクリックし。 YESボタンを押すと、楽器に位置赤色のX線通電表示が点灯します。 注：表示も制御ソフトウェア窓の機器ステータスボックスの点滅電圧アイコンで表示されます。スキャンは4.5分で完了します。 X線管は自動的にオフになり、機器上および制御ソフトウェアのウィンドウのコントロールパネルにある赤いX線通電表示が暗くなります。突起は自動的にソートされ、PROGされますRESSはGetSynchronizedRawウィンドウに表示される緑色のプログレスバーで表示されます。心臓周期の拡張末期と収縮末期の段階を表すボリュームセットは自動的に2-3追加分以内に再構築されます。 注：スキャンは制御ソフトウェアのウィンドウのコントロールパネルに緊急停止ボタンをクリックするか、機器の前面パネルにある機械式非常停止ボタンを押して中止します。 横断、冠状、及び2Dビューアソフトウェアの再構成のサジタルビューを観察します。取得した画像の品質を確認するために数秒かかります。麻酔の不満レベルによって引き起こされる可能性が動物の動きの兆候を探してください。必要に応じて、適切な修正を行い、スキャンを繰り返します。 注：画像内の構造は、二重エッジに示され、二倍、またはすじで示されている場合、これらは、麻酔のレベルが不十分であり得ることを示すことができ、通常の「赤旗」であり、その動物は、スキャン中に移動しました。このような場合には、麻酔のレベルを調整する必要があり、スキャンを再取得する必要があります。 スキャナから動物を削除し、監督の下で麻酔から完全に回復を可能にします。 コントラスト取り込み（造影剤注入後3〜6時間）の代謝段階の間に追加のマイクロCTスキャンを取得します。 注：C57BL / 6およびBALB / cマウスの平均心筋強化値についての詳細はDetombeらとアシュトンら 22,23によって出版されました。 4.ミクロデータ分析 12ソフトウェアの分析に拡張末期と収縮末期VOXファイルの両方をロードします。 斜めセクションモジュールでロードされた各画像を開き、短軸像の再編成を行います。 画像処理時間を最小限にするために、画像計算モジュールの小区域/パッドボリューム機能を用いて画像をトリミング考えます。両方のボリュームについては、同一のSを維持ubRegion LowとHigh X、Y、Z寸法。 両方のボリュームを追加し、ボリュームの編集モジュールを開きます。必要に応じて構造のより良い視覚化のために、画像強度を調整します。 心内膜輪郭セグメンテーションを行います。左心室腔が心筋から線引きされるように、ボリュームの編集モジュールを選択し、オブジェクト抽出の半自動]タブから、左心室（LV）にシード点を設定し、しきい値を調整します。しきい値を決定するには、自動閾値化アルゴリズムやラインプロファイルモジュールで決定全幅半最大値（FWHM）を使用します。 大動脈に広がる地域を防止するために、僧帽弁尖面に沿って限界を描き、セグメント化を完了するために、抽出オブジェクトボタンをクリックします。拡張末期と収縮末期容積の両方が自動的に処理されます。 （ 例えば LVキャビティ）領域に名前を付け、対応するファイルのディレクトリへのオブジェクトのマップを保存します。 PerfoRM心外膜輪郭セグメンテーション。新しいオブジェクトを追加し、ボリュームの編集モジュールの半自動または手動のいずれかのセグメント化ツールを使用して、心外膜心臓表面のセグメンテーションを行います。両方の拡張末期と収縮末期輪郭が正しく識別されていることを確認してください。必要な場合は、手動調整を行います。 領域 （例えばLV心筋）に名前を付け、対応するファイルのディレクトリへのオブジェクトのマップを保存します。 注：空間フィルタモジュールとフィルタリング画像がさらにセグメント化の速度及び品質を向上させるために行うことができます。 オブジェクト・マップから体積測定値を抽出するために（保存）インタレスト・モジュールの地域で追加さボリュームを開きます。補正されたマップがロードされていることを確認し、サンプルのオプションウィンドウを開き、LV空洞とLV心筋の両方のオブジェクトが選択されていることを確認し、サンプル画像]ボタンをクリックします。ログファイルを保存します。 心機能および代謝の地域分析のために、ラジアルディを使用インタレスト・モジュールの地域のviderツールは、さらにセグメント化されたボリュームをさらに分割します。 グローバルおよびリージョナル・ハートパラメータの5.計算左心室ストロークボリューム（LVSV）を計算するには、左心室拡張末期容積（LVEDV）から左心室収縮末期容積（LVESV）を引きます。 LVSV = LVEDV – LVESV。 左室駆出率（LVEF）を計算するには、左心室拡張末期容積（LVEDV）によって左心室ストロークボリューム（LVSV）を分割して100％を掛け： LVEF = LVSV / LVEDV * 100％。 心拍出量（CO）を計算するために、心拍数（HR）による左室一回拍出量（LVSV）を乗算します。 CO = LVSVの*のHR。 左心室の心筋質量（LVMM）を計算するには、左ventrから心内膜表面（LVMV ENDO）によって結合された左心室の心筋壁の量を差し引きますicular心外膜表面（LVMV EPI）によって結合された心筋壁の量、および心筋の比重を掛け、1.05グラム/ cm 3で： LVMM =（LVMV EPI – LVMV ENDO）* 1.05; 左心室の心筋の質量指数（LVMMI）を計算するには、マウスの体重（BW）により、左心室の心筋質量（LVMMを）分けます： LVMMI = LVMM / BW; 左心室の心筋梗塞サイズ（％LVMIS）の割合を計算するために、全体の左心室の心筋ボリューム（LVMV TOTAL）により梗塞した心筋（LVMV MI）の左室容積を分割し、100％を掛け： ％LVMIS = LVMV MI / LVMV 合計 * 100％。 注：LVMM、LVMMI、および％LVMISの計算については、対応する拡張末期や収縮末期のデータセットから内視と心外膜体積測定を使用しています。平均収縮終期およびエンド-ジを報告astolic指標。 分節左心室壁運動異常（LVWM）を計算するために、心室拡張末期壁径（LVEDWD）左分節から心室収縮末期壁直径（LVESWD）左の分節を引きます： LVWM = LVEDWD – LVESWD。 周極性マップ（ブルズアイ極プロット）として結果を表示します。 分節左心室壁肥厚（％のLVWTh）を計算するには、心室収縮末期の壁の厚さ（LVESWTh）左分節から心室拡張末期壁の厚さ（LVEDWTh）左の分節を引き、分節による除算は、心室拡張終期の壁を残しました厚さ（LVEDWTh）、および100％を掛け： ％LVWTh =（LVESWTh – LVEDWTh）* 100％/ LVEDWTh。 周極性マップ（ブルズアイ極プロット）として結果を表示します。 地域の駆出率（％REFを）計算するには、分節左心室収縮末期の二乗を減算壁の心室拡張末期壁径（LVEDWD）を左分節の広場から直径（LVESWD）、心室拡張終期壁径（LVEDWD）を左分節の二乗で割って、100％を掛け： ％のREF =（LVEDWD 2 – LVESWD 2）/ LVEDWD 2 * 100％。 周極性マップ（ブルズアイ極プロット）として結果を表示します。 局所心筋灌流およびコントラスト取り込みを提示するために、平均強度値は、CT値（ハウンズフィールド単位、HU）に変換。水で満たされた小型無線-透明チューブを使用して、HU 0に1000年HU、および水 – 動物への外に選択した領域から選択された空気を再スケーリングすることにより、両方の拡張末期と収縮末期のデータセットに変換します。周極性マップ（ブルズアイ極プロット）として結果を表示します。 6.統計解析平均±標準偏差（SD）として、すべての極座標表示データを表します。 STATを評価します一方向分散分析（ANOVA）または別の適切な技術を用いてistical差。