Denne prosedyren utfører langvarig in vivo intracellulære opptak fra enkeltnerveceller under fysiologisk relevante hjernetilstander og etter fullstendig avskaffelse av pågående elektriske aktivitet, noe som resulterer i en isoelektrisk hjernen tilstand. De fysiologiske konstanter av dyret er nøye overvåket under overgangen til kunstig koma tilstand.
Måten neuroner behandle informasjon avhenger både av deres iboende membranens egenskaper og på dynamikken i den synaptiske afferent nettverket. Spesielt endogent generert nettverk aktivitet, som sterkt varierer som en funksjon av tilstanden av årvåkenhet, modulerer neuronal beregning betydelig. For å undersøke hvordan forskjellige spontane cerebrale dynamikk påvirke enkelt neuroner 'integrerende egenskaper, har vi utviklet en ny eksperimentell strategi i rotte som består i å undertrykke in vivo alle cerebral aktivitet ved hjelp av en systemisk injeksjon av en høy dose av natriumpentobarbital. Kortikale aktiviteter, kontinuerlig overvåket av kombinert electrocorticogram (ECOG) og intracellulære opptakene blir gradvis bremset ned, noe som fører til en jevn isoelektrisk profil. Denne ekstreme hjernen staten, sette rotte inn i en dyp koma, ble nøye overvåket ved å måle de fysiologiske konstanter av dyret gjennom eksperimenter. intracellulær recordings tillatt oss å karakterisere og sammenligne integrerende egenskaper av samme nervecellen innebygd i fysiologisk relevante cortical dynamikk, slik som de møtte i sove-våkne syklus, og når hjernen var fullt stille.
I fravær av eventuelle miljømessige stimuli eller atferds oppgaver, genererer den "hvile" brain en kontinuerlig strøm av elektrisk aktivitet som kan tas opp fra hodebunnen, som (EEG) bølger. Den intracellulære korrelat av dette endogene cerebrale aktivitet er kjennetegnet ved bakgrunn membranspenningsvariasjoner (også kjent som "synaptisk noise"), som er sammensatt av en kombinasjon av eksitatoriske og hemmende synaptiske potensialer som reflekterer den pågående aktivitet av afferent nettverk 1,2. Dette spontan aktivitet varierer i frekvens og amplitude med de forskjellige tilstander av årvåkenhet. Belyse effekten av nettverksaktivitet på oppstemthet og responsen til enkeltnerveceller er en av de store utfordringene i nevrovitenskap 3,4.
Mange eksperimentelle og beregnings studier har utforsket den funksjonelle effekten av pågående synaptisk aktivitet på integrerende properties av nerveceller. Men rollen til de ulike nevrale parametere påvirket av bakgrunns synaptiske støy fortsatt ukjent. For eksempel har det midlere nivå av membran depolarisering blitt funnet positivt eller negativt 5,6 7-9 korrelert med evnen til sanseinntrykk for å utløse aksjonspotensialer. Videre, mens noen undersøkelser tyder på at svingninger i membranpotensialet, som følge av en kontinuerlig varierende strøm av afferent synaptiske innganger, sterkt påvirker respons fra enkeltnerveceller ved å modulere gevinsten av deres input-output forhold 3,10-13, andre viser at endringer i membraninngangs konduktans mediert av shunting inhibering er tilstrekkelig til å modulere den neuronale forsterkningen uavhengig av størrelsen av membransvingninger 14,15. Til slutt, nyere studier utført på våken dyr streket hvordan behandlingen av sensorisk informasjon i enkelt nevron kritisk avhengig av tilstand av årvåkenhet ennd gjeldende atferds etterspørselen 16,17.
En enkel strategi for å klargjøre den funksjonelle rollen til en gitt prosess i et sterkt sammenhengende system, er å bestemme hvor dens fravær spesifikt endrer funksjon av systemet. Denne metoden har vært mye brukt i nevrovitenskap forskning, for eksempel ved hjelp av eksperimentelle lesjoner eller inaktivering av ulike hjerneområder 18-21, eller farmakologisk blokkering av spesifikke ionekanaler 22,23. Spesielt, har det vært anvendt in vivo for å avsløre hvor funksjonelle tilkobling og nettverksdynamikk påvirke enkelt celle beregning 24-27. Men til dags dato lokale manipulasjoner ment å blokkere avfyring av nevroner og / eller forstyrre deres grunnleggende biofysiske egenskaper kan være delvis effektive og er begrenset til relativt små hjernevolum 28.
For å overvinne disse begrensningene, har vi utviklet en ny in vivo eksperimentell tilnærming irotte å sammenligne elektrofysiologiske egenskapene til enkelt nevroner registrert i en gitt hjerne tilstand, dvs. innebygd i en bestemt nettverk dynamisk, til de som ble oppnådd etter fullstendig undertrykkelse av hele hjernen synaptisk aktivitet 29. I kontrollbetingelsene, ble to adskilte kortikale dynamikk bli generert. Søvn-lignende electrocorticographic (ECOG) mønstre ble indusert ved injeksjon av moderate doser av natrium pentobarbital. Alternativt kan fast ECOG bølger med liten amplitude sammenlignes med det kortikale aktivitet som ligger under våken tilstand (våken-lignende mønster) fremstilles ved injeksjon av fentanyl. Deretter, og samtidig opprettholde den samme ECOG og intracellulære opptaket, ble en fullstendig stanse av endogen hjernens elektriske aktivitet som oppnås ved systemisk injeksjon av en høy dose av natriumpentobarbital, karakterisert ved isoelektrisk ECOG og intracellulære aktivitet. På grunn av at induksjon av en slik ekstrem koma kan potensielt ha dødelig derav følgendeces på biologiske funksjoner, en forsiktig og kontinuerlig overvåking av de fysiologiske variablene var avgjørende. Derfor har vi omhyggelig fulgt hjerteslagfrekvens, slutttidevanns CO 2 konsentrasjon (EtCO 2), O 2 metning (SpO2) og kjernetemperaturen av rotter gjennom forsøkene.
Vi evaluerer enkelt nevroner eiendommer i løpet av disse forskjellige stater bruker skarpe mikroelektroder, som er spesielt egnet for lange og stabile opptak i vivo. Den fremgangsmåte som er beskrevet her, kan kombineres med andre elektrofysiologiske og bildedannende fremgangsmåter og kan bli utvidet til andre dyremodeller.
Vi beskriver her en ny metode for å undertrykke in vivo spontan cerebral elektrisk aktivitet ved både nettverk og cellulære nivåer. Denne fremgangsmåten fører til ekstrem hjernen tilstand, kjent som isoelektrisk komatøs 41. Fra et klinisk synspunkt, er en slik electrocerebral inaktivitet den mest alvorlige avvik som kan ses på EEG. Den er for det meste forbundet med en irreversibel koma, med alle pasienter enten dør eller fortsetter i en vegetativ tilstand 42, men kan i det minste…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Fondation de France, Institut National de la Santé et de la Recherche MEDICALE, Pierre & Marie Curie University og programmets Investissements d'avenir 'ANR-10-IAIHU-06.
Sodium Pentobarbital | Centravet | Pentobarbital | |
Ketamine 500 | Merial | Imalgène 500 | |
Fentanyl | Janssen-Cilag | Fentanyl | |
Xylocaine | Centravet | Xylovet | |
Gallamine triethiodide | Sigma | G8134 | |
ECoG amplifier | A-M Systems | AC amplifier, Model 1700 | |
Intracellular amplifier | Molecular Devices | Axoclamp 900A | |
Data acquisition interface | Cambridge Electronic Design | CED power 1401-3 | |
Data analysis software | Cambridge Electronic Design | Spike2 version 7 | |
micromanipulator | Scientifica | IVM-3000 | |
Capillary Puller | Narishige | PE-2 | |
Borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | GC150F-10 | |
Silver wire 0.125mm (intracellular recording) | WPI | AGT0525 | |
Ag-AgCl reference | Phymep | E242 | |
Silver wire 0.25mm (ECoG recording) | WPI | AGT1025 | |
Artificial respiration system | Minerve | Alpha Lab | |
Physiological parameters monitoring | Digicare | LifeWindow Lite | |
Heating Blanket | Harvard Apparatus | 507215 | |
Stereomicroscope | Leica | M80 | |
Scissors | FST | 15005-08 | |
Forceps Dumont #5 | FST | 11295-10 | |
Forceps Dumont #5SF | FST | 11252-00 | |
IP Polyurethane catheter – 0.43×0.69mm | Instech | BTPU-027 | |
Silicon elastomere | WPI | KWIK-CAST | |
Dental drill | NSK | Y1001151 and P496 | |
Surgical glue | 3M | vetbond |