Создание CRISPR / cas9 опосредованного моноаллельной Пропуски для изучения Enhancer Функция в эмбриональных стволовых клетках мышей
Summary
Experimental validation of enhancer activity is best approached by loss-of-function analysis. Presented here is an efficient protocol that uses CRISPR/Cas9 mediated deletion to study allele-specific regulation of gene transcription in F1 ES cells which contain a hybrid genome (Mus musculus129 x Mus castaneus).
Abstract
Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often located distally from the regulated gene in intergenic regions or even within the body of another gene. The position independent nature of enhancer activity makes it difficult to match enhancers with the genes they regulate. Deletion of an enhancer region provides direct evidence for enhancer activity and is the gold standard to reveal an enhancer’s role in endogenous gene transcription. Conventional homologous recombination based deletion methods have been surpassed by recent advances in genome editing technology which enable rapid and precisely located changes to the genomes of numerous model organisms. CRISPR/Cas9 mediated genome editing can be used to manipulate the genome in many cell types and organisms rapidly and cost effectively, due to the ease with which Cas9 can be targeted to the genome by a guide RNA from a bespoke expression plasmid. Homozygous deletion of essential gene regulatory elements might lead to lethality or alter cellular phenotype whereas monoallelic deletion of transcriptional enhancers allows for the study of cis-regulation of gene expression without this confounding issue. Presented here is a protocol for CRISPR/Cas9 mediated deletion in F1 mouse embryonic stem (ES) cells (Mus musculus129 x Mus castaneus). Monoallelic deletion, screening and expression analysis is facilitated by single nucleotide polymorphisms (SNP) between the two alleles which occur on average every 125 bp in these cells.
Introduction
Транскрипциональные регуляторные элементы имеют решающее значение для пространственно-временной тонкой настройки экспрессии генов в процессе развития 1 и модификации этих элементов может привести к болезни из – за аберрантной экспрессии генов 2. Многие болезни ассоциированные регионы , выявленные генома широких исследований ассоциации в некодирующих регионах и имеют особенности транскрипционных энхансеров 3-4. Идентификация и улучшающие сопоставления их с генами , которые они регулируют затруднено , поскольку они часто расположены несколько т.п.н. от генов , которые они регулируют и могут быть активированы в порядке 5-6 тканесецифического. Прогнозы Enhancer обычно основаны на модификации гистонов марок, медиаторов-Cohesin комплексов и связывание транскрипции типа специфических клеток факторов 7-10. Проверка предсказанных усилителями чаще всего делается с помощью основанного анализа вектора , в котором энхансер активирует экспрессию гена – репортера , 11-12. Эти данные обеспечивают Valuable информация о регуляторного потенциала предполагаемых последовательностей энхансера, но не раскрывают их функции в их эндогенного геномного контекста или идентифицировать гены, которые они регулируют. редактирования Геном служит мощным инструментом для изучения функции транскрипционных регуляторных элементов в их эндогенного контекст с потерей функции анализа.
Последние достижения в области редактирования генома, а именно / cas9 системы редактирования генома CRISPR, облегчают исследование функции генома. Система / cas9 CRISPR проста в использовании и предназначен для многих биологических систем. Белок cas9 нацелен на определенный сайт в геноме с помощью РНК направляющей (gRNA) 13. Комплекс SpCas9 / gRNA сканирует геном для своей целевой геномной последовательности , которая должна быть не менее 5 'к последовательности protospacer смежно мотив (РАМ), NGG 14-15. База спаривание gRNA к своей цели, то 20 нуклеотидов (нт) последовательность, комплементарную gRNA, активирует нуклеазы активность SpCas9 приводит в DOUBLе нить брейк (DSB) 3 б.п. выше последовательности PAM. Специфичность достигается за счет полного спаривания оснований в запальной зоне gRNA, 6-12 нт рядом с ПАС; И наоборот, не соответствует 5 'от семени, как правило , переносится 16-17. Введенный DSB можно отремонтировать либо негомологичные конец соединительной (NHEJ) репарации ДНК или гомологии направлены ремонт репарации ДНК (HDR) mechanisms.NHEJ часто создает вставки / удаления (вставкам) из нескольких пар оснований на целевом сайте, что может привести к нарушению открытая рамка считывания (ORF), гена. Для того, чтобы генерировать более крупные делеции в геноме двух gRNAs, которые фланкируют область интереса, может быть использован 18-19. Этот подход особенно полезен для изучения транскрипционных энхансеров , сгруппированных в локус контроля областей или супер-усилителями , которые больше , чем обычные усилители 9,18,20-22.
Моноаллельной делеции являются ценным моделью для изучения цис -regulation транскрипции. Наблюдаемое чане в уровне транскрипта после моноаллельной удаления энхансер коррелирует с ролью этого усиливающего в регуляции генов без искажающих эффектов, которые могут возникнуть при транскрипции обоих аллелей влияет, потенциально влияющих на клеточную пригодность. Оценивая приведенное выражение трудно, однако без способности различать удаленные от дикого типа аллеля. Кроме того, генотипирование делеции в каждом аллеля без способности различать два аллеля является сложной задачей, особенно для больших удалений> 10 кб до 1 Мб 23 , в котором оно трудно усилить весь дикий регион типа с помощью ПЦР. Использование клеток F1 ES , генерируемых путем скрещивания Mus Musculus 129 с Mus castaneus позволяет двум аллели быть дифференцированы по аллель-специфической ПЦР 18,24. Гибридный генома в этих клетках способствует аллель специфический скрининг удаления и анализа экспрессии. В среднем является SNP каждые 125 пар оснований между этими двумя геномами, Обеспечивая гибкость при проектировании праймера для экспрессии и генотипирование анализов. Наличие одного SNP может влиять на температуру плавления праймера (Т м) и целевой специфичность в реальном масштабе времени количественной ПЦР (КПЦР) амплификации , допускающие дискриминацию двух аллелей 25. Кроме того несоответствие в пределах 3' – конца праймера в значительной степени влияет на способность ДНК – полимеразы , чтобы простираться от праймера амплификации , предотвращая нежелательную мишени аллеля 26. Описанная в следующем протоколе является использование клеток F1 ES для аллельных специфических усиливающих делеции более 1 кб и последующего анализа экспрессии с помощью / cas9 системы редактирования генома CRISPR (Рисунок 1).
Рисунок 1. Enhancer удаление с помощью CRISPR / cas9 для изучения цис -regавляет экспрессии генов. (A) F1 ES – клетки , генерируемые помесь Mus Musculus 129 и Mus castaneus используются для обеспечения аллель специфического удаления. (B) , два направляющих РНК (gRNA) используются , чтобы вызвать большой cas9-опосредованное удаление области энхансера. (C) наборов праймеров используются для идентификации больших моно- и би-аллельные делеции. Оранжевые праймеры внутренние праймеры, пурпурные праймеры являются внешними праймеры и зеленые праймеры фланкирующие праймеры gRNA. (D) Изменения в экспрессии генов контролируются с помощью аллель-специфической КПЦР. РФС обозначает относительные единицы флуоресценции. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Protocol
Representative Results
Discussion
CRISPR / cas9 технологии редактирования опосредованный геном обеспечивает простой, быстрый и недорогой способ для модификации генома. Подробно здесь, чтобы генерировать и анализировать моноаллельную энхансер для удаления функционального энхансер характеризации метод использует ОНП в кл…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank all the members of the Mitchell lab for helpful discussions. This work was supported by the Canadian Institutes of Health Research, the Canada Foundation for Innovation and the Ontario Ministry of Research and Innovation (operating and infrastructure grants held by JAM).
Materials
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S | high fidelity DNA polymerase used in gRNA assembly |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611L | |
| gRNA_Cloning Vector | Addgene | 41824 | A target sequence is cloned into this vector to create the gRNA plasmid |
| pCas9_GFP | Addgene | 44719 | Codon-optimized SpCas9 and EGFP co-expression plasmid |
| AflII | NEB | R0520S | |
| EcoRI | NEB | R3101S | |
| Neon Transfection System 100 µL Kit | Life Technologies | MPK10096 | Microporator transfection technology |
| prepGEM | ZyGEM | PT10500 | genomic DNA extraction reagent |
| Nucleo Spin Gel & PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.5 | |
| High-Speed Plasmid Mini Kit | Geneaid | PD300 | |
| Maxi Plasmid Kit Endotoxin Free | Geneaid | PME25 | |
| SYBR select mix for CFX | Life Technologies | 4472942 | qPCR reagent |
| iScript cDNA synthesis kit | Bio-rad | 170-8891 | Reverse transcription reagent |
| 0.25% Trypsin with EDTA | Life Technologies | 25200072 | |
| PBS without Ca/Mg2+ | Sigma | D8537 | |
| 0.5M EDTA | Bioshop | EDT111.500 | |
| HBSS | Life Technologies | 14175095 | |
| 1M HEPES | Life Technologies | 13630080 | |
| BSA fraction V (7.5%) | Life Technologies | 15260037 | |
| Max Efficiency DH5α competent cells | Invitrogen | 18258012 | |
| FBS | ES cell qualified | FBS is subjected to a prior testing in mouse ES cells for pluripotency | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050 | |
| DMEM | Life Technologies | 11960069 | |
| Pencillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360 | |
| Non-essential aminoacid | Invitrogen | 11140 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| 96-well plate | Sarstedt | 83.3924 | |
| Sealing tape | Sarstedt | 95.1994 | |
| CoolCell LX | Biocision | BCS-405 | alcohol-free cell freezing container |
| CHIR99021 | Biovision | 1748-5 | Inhibitor for F1 ES cell culture |
| PD0325901 | Invivogen | inh-pd32 | Inhibitor for F1 ES cell culture |
| LIF | Chemicon | ESG1107 | Inhibitor for F1 ES cell culture |
References
- Sagai, T., Hosoya, M., Mizushina, Y., Tamura, M., Shiroishi, T. Elimination of a long-range cis-regulatory module causes complete loss of limb-specific Shh expression and truncation of the mouse limb. Development. 132 (4), 797-803 (2005).
- Kleinjan, D. A., Lettice, L. A. Long-range gene control and genetic disease. Adv Genet. 61, 339-388 (2008).
- Visel, A., Rubin, E. M., Pennacchio, L. A. Genomic views of distant-acting enhancers. Nature. 461 (7261), 199-205 (2009).
- Maurano, M. T., et al. Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA. Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).
- Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
- Shen, Y., et al. A map of the cis-regulatory sequences in the mouse genome. Nature. 488 (7409), 116-120 (2012).
- Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).
- Whyte, W. A., et al. Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
- Chen, C. Y., Morris, Q., Mitchell, J. A. Enhancer identification in mouse embryonic stem cells using integrative modeling of chromatin and genomic features. BMC Genomics. 13 (1), 152 (2012).
- Patwardhan, R. P., et al. Massively parallel functional dissection of mammalian enhancers in vivo. Nat Biotechnol. 30 (3), 265-270 (2012).
- Melnikov, A., et al. Systematic dissection and optimization of inducible enhancers in human cells using a massively parallel reporter assay. Nat Biotechnol. 30 (3), 271-277 (2012).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).
- Cho, S. W., et al. Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickases. Genome Res. 24 (1), 132-141 (2014).
- Zhou, H. Y., et al. A Sox2 distal enhancer cluster regulates embryonic stem cell differentiation potential. Genes Dev. 28 (24), 2699-2711 (2014).
- Fujii, W., Kawasaki, K., Sugiura, K., Naito, K. Efficient generation of large-scale genome-modified mice using gRNA and CAS9 endonuclease. Nucleic Acids Res. 41 (20), e187 (2013).
- Tuan, D. Y., Solomon, W. B., London, I. M., Lee, D. P. An erythroid-specific, developmental-stage-independent enhancer far upstream of the human ‘beta-like globin’ genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (8), 2554-2558 (1989).
- Amano, T., et al. Chromosomal dynamics at the Shh locus: limb bud-specific differential regulation of competence and active transcription. Dev Cell. 16 (1), 47-57 (2009).
- Li, Y., et al. CRISPR reveals a distal super-enhancer required for Sox2 expression in mouse embryonic stem cells. PLoS One. 9 (12), e114485 (2014).
- Canver, M. C., et al. Characterization of genomic deletion efficiency mediated by clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 nuclease system in mammalian cells. J Biol Chem. 289 (31), 21312-21324 (2014).
- Mlynarczyk-Evans, S., et al. X chromosomes alternate between two states prior to random X-inactivation. PLoS Biol. 4 (6), e159 (2006).
- Lefever, S., Pattyn, F., Hellemans, J., Vandesompele, J. Single-nucleotide polymorphisms and other mismatches reduce performance of quantitative PCR assays. Clin Chem. 59 (10), 1470-1480 (2013).
- Huang, M. M., Arnheim, N., Goodman, M. F. Extension of base mispairs by Taq DNA polymerase: implications for single nucleotide discrimination in PCR. Nucleic Acids Res. 20 (17), 4567-4573 (1992).
- Keane, T. M., et al. Mouse genomic variation and its effect on phenotypes and gene regulation. Nature. 477 (7364), 289-294 (2011).
- Yalcin, B., et al. Sequence-based characterization of structural variation in the mouse genome. Nature. 477 (7364), 326-329 (2011).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nat Methods. 7 (11), 901-903 (2010).
- Ding, Q., et al. Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs. Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41), (2010).
- Forlenza, M., Kaiser, T., Savelkoul, H. F., Wiegertjes, G. F. The use of real-time quantitative PCR for the analysis of cytokine mRNA levels. Methods Mol Biol. 820, 7-23 (2012).
- Wu, J. H., Hong, P. Y., Liu, W. T. Quantitative effects of position and type of single mismatch on single base primer extension. J Microbiol Methods. 77 (3), 267-275 (2009).
- Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. The long-range interaction landscape of gene promoters. Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).
