This protocol describes a technique to assess changes in the maternal vasculature during pregnancy in mice. Using stereological methods, remodeling of the decidual spiral arteries is assessed quantitatively and the results confirmed qualitatively using immunohistochemistry.
The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the maternal circulation. The maternal uterine vasculature needs to adapt to this temporary demand and the success of this arterial remodeling process has implications for fetal growth. Cells of the maternal immune system, especially natural killer (NK) cells, play a critical role in this process. Here we describe a method to assess the degree of remodeling of maternal spiral arteries during mouse pregnancy. Hematoxylin and eosin-stained tissue sections are scanned and the size of the vessels analysed. As a complementary validation method, we also present a qualitative assessment for the success of the remodeling process by immunohistochemical detection of smooth muscle actin (SMA), which normally disappears from within the arterial vascular media at mid-gestation. Together, these methods enable determination of an important parameter of the pregnancy phenotype. These results can be combined with other endpoints of mouse pregnancy to provide insight into the mechanisms underlying pregnancy-related complications.
Udvekslingen af næringsstoffer, gasser og affaldsprodukter under eutherian drægtighed medieres af moderkagen. I den kvindelige reproduktive tarmkanalen, livmoderarterierne er de vigtigste ledninger af blod til livmoderen. Efter implantation disse gren til specialiserede fartøjer kaldes spiral arterier, der coil gennem decidua basalis mod fetoplacental enhed. Diameter og elasticitet af disse spiral arterier, som er omgivet af leukocytter, især uterin naturlige dræberceller (UNK) celler, diktere omfanget og hastigheden af blod til rådighed for placenta 1,2. Korrekt hæmodynamiske ændringer som følge af omdannelse af de spiralformede arterier er kritiske for vellykket graviditet.
Mens de underliggende mekanismer varierer i detaljer mellem human og murin graviditet, det endelige resultat af remodelleringsprocessen i begge arter er dilateret, høj ledningsevne vaskulatur, som mister sin glatte muskulatur lag. Hos mus, UNK celleafledt interferon (IFN-) γ er nødvendig for at fremkalde disse ændringer på omkring midten af drægtigheden 3-5. Mus, der mangler enten NK-celler eller komponenter i IFN-γ signalvej undlader at gennemgå disse ændringer, og dette er forbundet med reduceret føtal vækst 6,7, understreger vigtigheden af en tilstrækkelig blodforsyning til fetoplacental enhed. I den tidlige graviditet, det interstitielle og endovaskulær invasion af extravillous trofoblast og deres samspil med unk celler er vigtige for at fremkalde vaskulære forandringer og fremme fostervækst 8-10. UNK celler kan orkestrere trophoblast invasion human gennem chemokiner 11 og cytokiner, såsom granulocyt-makrofag – kolonistimulerende faktor (GM-CSF) 12. Shallow trofoblast invasion er forbundet med reduceret arteriel remodeling og graviditet komplikationer såsom præeklampsi 9.
Denne protokol er baseret på pionerarbejde Anne Croy der beskrev vigtigerolle i immunsystemet og især NK-afledte IFN-γ for en vellykket vaskulær remodellering ved immunohistokemi og elegant transfer eksperimenter 5,13. Her beskriver vi en hurtig og økonomisk måde at vurdere remodeling status spiral arterier. Selvom vores laboratorium rutinemæssigt vurderer dette på midten drægtighed (drægtighed dag (gd) 9.5) 14, remodeling proces finder sted mellem gd8.5 og 12,5 15. Fremkomsten af automatiserede dias scannere har i høj grad lettet vurderingen af fartøjet og lumen områder fra sektioner, og vi fandt dette at være en mere reproducerbar tilgang end at måle fartøj diametre. Tilsætningen af immunhistokemisk påvisning af SMA giver mulighed for en enkel validering af de opnåede resultater fra stereologiske vurdering. Som med alle stereologiske teknikker, anbefales det at foretage en vurdering som et blindet forsøg af mindst to censorer. Til dette formål kan der indføres en randomisering skridt, når serielt skåretTing prøverne, så efterforskerne vurderer dias ikke kender hvorfra forsøgsgruppe prøverne kommer.
Det overordnede mål med denne protokol er at give et pålideligt værktøj til nøje at vurdere ombygningen af spiralformede arterier i mus med definerede mødres og faderlige genotyper, i forbindelse med musemodeller for graviditetsrelaterede komplikationer. Resultaterne understreger afhængigheden af UNK celler af denne proces, som er afgørende for en normal føtal vækst.
Protokollen præsenteres her er designet til at give en reproducerbar metode til at vurdere de vaskulære ændringer, der er nødvendige for en vellykket graviditet. Kritisk for succes i denne evaluering er kvaliteten af de vævssnit. Både præcist at bestemme gestationsalder af implantationssteder samt pålidelig ligere livmoderarterierne, er afgørende skridt. Ændringer i parametre såsom tidspunktet for fiksering, tissue-behandlingsprotokol, etc., kan også påvirke resultatet. For en fordomsfri stereologiske vurdering, er det vigtigt at måle det samme antal fartøjer i hver implantation site. Det anbefales at måle 5 fartøjer pr implantationssted og hver implantation websted i tre eksemplarer. Gennemsnittet af disse 15 målinger repræsenterer middelstørrelse af de 5 største skibe.
På baggrund af data fra alymphoid rag2 – / – IL2rg – / – mus vist her, fandt vi denne protocol anvendelig til en række modeller af utilstrækkelig maternel immunfunktion, herunder en af inhiberede NK-celler 14. Defekter i arteriel remodeling har også vist sig i modeller for forringet trophoblast invasion 18 og de teknikker der er beskrevet her, kan være nyttigt at vurdere vaskulaturen i disse tilfælde. Vi optimeret og valideret denne protokol for undersøgelse af decidua vaskulær remodellering medio drægtighed i mus, men det er også tænkeligt at tilpasse denne protokol til at arbejde i andre modelsystemer (f.eks rotter) eller endog i andre organer. Mens vi finder, at NK-afhængige ombygning kan håndfast vurderes på gd9.5, kan det ændres til andre tidspunkter såsom gd12.5, når moderens vaskulatur er fuldstændig renoveret. På dette tidspunkt, endovaskulær trofoblast invasion er dybere 16 og dette tidspunkt kan være mere egnet til undersøgelser af den rolle, trofoblast for vaskulære forandringer. Hvis der ønskes yderligere kvantitative udlæsninger,undersøgere kan også øge antallet af snit farvet for SMA og vurdere procentdelen af delvist gentegnet fartøjer inden for hver implantationsstedet.
En begrænsning af denne protokol er den beskrivende karakter af histologiske undersøgelser. Funktionelle assays, dog kun langsomt ved at blive tilgængelige (såsom Doppler ultralyd 19). Disse teknikker kræver teknisk ekspertise og meget højere udgifter til erhvervelse og vedligeholdelse af udstyr, men har den fordel, at en langsgående in vivo udlæsning for effekten af de ændringer, der kan observeres histologisk. En mulig ulempe ved alle stereologiske undersøgelser er subjektivitet efterforskerne. Til dette formål kan ved hjælp af to uafhængige censorer, der analyserer alle prøver selvstændigt bidrage til at undgå dette problem. Mens protokollen beskrevet her giver indsigt i, hvor meget blod kan nå fetomaternal interface, kan det være fordelagtigt at kombinere det med komplementary tilgang vurdere den samlede mængde blod på et givet tidspunkt i vaskulaturen gennem plastik kaster 16.
Styrken ved denne protokol er, at den kombinerer to uafhængige tilgange. Vaskulær ændringer først vurderes kvantitativt ved stereologi og resultatet er derefter valideres kvalitativt immunhistokemi. Pålideligheden af resultaterne kan styrkes yderligere ved randomisering prøverne. De forberedt til denne protokol prøver kan nemt bruges til også at undersøge andre parametre af graviditeten såsom decidualisation, udvikling af mesometrial lymfoide aggregat af graviditet (MLAp) eller immunodetektion af celler af interesse, til nøje at vurdere en graviditet fænotype ved midgestation.
Arteriel remodeling er et afgørende skridt for ukomplicerede graviditeter i kvinder og svigt af disse ændringer underbygger de store obstetriske syndromer (GO), nemlig præeklampsi, fostervækst begrænsning ogdødfødsel. Vi præsenterer her teknikker til nøje at vurdere en graviditet fænotype i musemodeller, der efterligner nogle karakteristika for patofysiologien af GOS.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank all members of the Colucci lab for helpful discussions. This work was funded by The Wellcome Trust [094073/Z/10/Z], The Centre for Trophoblast Research and The British Heart Foundation.
C57BL/6 mice (8-12 weeks old) | Charles River | ||
Dental floss | |||
Polystyrene | Used for holding tissue in place | ||
Straight dissection scissors | EMS | 72940 | |
25G needles | BD | 300600 | Used for holding tissue in place |
50 ml conical tubes | Falcon | 352070 | |
Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501128-4L | |
Phosphate buffered saline | Sigma | P3813-10PAK | |
Ethanol | Sigma | 32221-2.5L | |
Paraffin | Sigma | 327204-1KG | |
Xylene | Fisher Scientific | X/0250/17 | |
Automated tissue processor | Sakura | 6032 | |
Microtome | Leica | RM2245 | |
Slide rack | Sigma | Z710989 | |
Coplin jar | Sigma | S5891 | |
Purified water | |||
Hematoxylin solution, Gill No. 3 | Sigma | GHS332-1L | |
Eosin Y solution | Sigma | HT110116-500ML | |
Fume hood | |||
Xylene-based mounting media | VWR | 361254D | |
Slide scanner | Hamamatsu | NanoZoomer | |
Slide scanner software | Hamamatsu | NDP viewer | |
Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma | 32320 | Make 10 mM solution and adjust pH to 6 |
Pressure cooker | Used for antigen retrieval | ||
Heating plate | Used for antigen retrieval | ||
Hydrophobic barrier pen | Vector | H-4000 | |
Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H/1800/15 | |
Tris buffered saline | Sigma | T6664-10PAK | |
Mouse on mouse kit | Vector | BMK-2202 | Significantly reduces background |
Mouse anti-human smooth muscle actin | DAKO | M0851 | Cross-reacts with mouse |
IgG2a isotype control | DAKO | X0943 | |
Humidified chamber | Sigma | H6644 | |
3,3’-Diaminobenzidine solution | Sigma | D4293-5SET | |
Hydrochloric acid | Fisher Scientific | H/1050/PB17 |