产妇血管重构的评估在怀孕期间在小鼠子宫

在这个手稿中讨论的所有程序都是按照英国内政部法规和剑桥伦理审查委员会的批准。 1.标本采集设置使用8-12周龄的雌性C57BL / 6小鼠成年男性（最多2个每个女性的男性），下午定时交配。检查阴道塞的存在，作为交配的标志在随后的日子里的清晨。塞在早上马克gd0.5的存在。 上gd9.5，安乐死动物通过颈脱位和打开腹腔。需要注意的是安乐死的CO 2可能会引起血管扩张。 使用牙线轻轻结扎子宫动脉（图1，虚线箭头）。扎周围动脉牙线在每个子宫角，近端至卵巢的尖端，以及围绕子宫颈。 注意：不要破裂的血管，因为这可能会导致崩溃的动脉。 <利>迅速解剖子宫使用解剖剪刀，远侧切除整个子宫的三个连接点在子宫角和子宫颈的尖端。 将子宫，对准备好的聚苯乙烯片使两个角都沿着长轴从子宫颈相反的方向对齐。轻轻地伸展并销插入使用2-3个地下25针的地方。 浸入聚苯乙烯成制备50ml锥形管中。补足至50ml，用10％福尔马林中。定为5-6小时，在室温下进行。 丢弃福尔马林溶液和替换用50ml 1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）5分钟。 近侧到各端的连接点和近侧切除两个子宫角，以在中心子宫颈，修剪掉周围的植入位置的任何多余的脂肪和在PBS中清洗两次，每次5分钟，以去除福尔马林的痕迹。 存储在70％乙醇的样品在4℃（长达两周）直到加工。 注意：的Ethanol是高度易燃的。 使用使用表1所示的参数的自动处理系统。在石蜡单独嵌入的角，以便它们可以沿垂直于子宫的长轴进行切割。这确保了每个植入部位的最大面积将在块（图2A）的中间被暴露以供分析。 可选：这是针对该块的随机化方便的时间点，如果需要的。 用切片机，切断从块7微米厚的连续切片。在染色行HE每49微米间隔一个部分（H＆E，见2.1）。存储的剩余部分在室温下的SMA染色和其他下游应用。 解 时间 温度 70％乙醇 1小时 40℃ 100％乙醇 1小时 40℃ 100％乙醇 1小时 40℃ 100％乙醇 1小时 40℃ 100％乙醇 1小时 40℃ 100％乙醇 1小时 40℃ 100％乙醇 1小时 40℃ ：21px;“>二甲苯 1小时 40℃ 二甲苯 1小时 40℃ 二甲苯 1小时 40℃ 石蜡 1小时 63℃ 石蜡 1小时 63℃ 石蜡 1小时 63℃ 石蜡 1小时 63℃ 表1：设置用于子宫组织的处理设置用于自动组织处理概述 2. STEReological评估 H＆E染色 Deparaffinize切片浸入滑动地安装在滑动机架的100％二甲苯浴中10分钟，在室温下。 注意：二甲苯是易燃品，可疑致癌物是通过接触和吸入有毒。这项工作要在通风橱中进行，使用个人防护装备（PPE）。 浸入含有清洁二甲苯另外10分钟，在滑动浴。 顺序地浸入载玻片在含有100％的乙醇，95％乙醇，70％乙醇与纯净水，每次5分钟浴。 沉浸载玻片于50％吉尔否3苏木溶液，用纯化水稀释，5分钟。 注意：苏木是通过摄入和接触对眼睛有害。在处理时应佩戴合适的个人防护装备。 流动的自来水10分钟在染色槽洗幻灯片。 在1％的浸入滑动酸/醇溶液（1％10M的盐酸在70％乙醇），持续10秒和洗涤，并在染色槽流动的自来水。 浸泡在曙红溶液玻片30秒和下流动的自来水10分钟在染色槽清洗。 内通风橱，依次浸入载玻片在含有70％乙醇，95％乙醇和100％乙醇，每次5分钟浴。 浸入含有二甲苯10分钟洗澡幻灯片。 摩盖玻片用二甲苯基的安装平台。在之前的可视化，在显微镜下将载玻片在通风橱干燥水平地和彻底。 血管的大小和重塑状态体视评估对于每个着床部位，确定哪些部分是靠近正中矢状点。胎儿和胎盘显影之间的绒毛尿囊附着用作正中矢状点的良好指标。 选择3个部分，在49微米的间隔接近正中矢状点进行分析。扫描选定的幻灯片。为了避免增量泸静脉，这已被证明是更位于边缘的在植入部位16，限制在每个植入位点（图2A）的中央2/4的分析。 为了评估管腔大小，绘制血管周围的内侧，并记录此形状的面积。总容器大小，绘制围绕容器的外壁上，包括内皮细胞，周细胞和壁间白细胞。 注意：总血管大小的腔比为容器的重塑状态的代理。作为船只通过该部被切断沿平面线圈，可能存在在一个滑动同一动脉的多个横截面。避免测量同一动脉多次。 记录在每个种植部位与最大和最圆流明的5艘测量。测量一式三份的每个植入位点（三个部分隔开49微米彼此分开）。这些15个测量represe平均NTS的最大船只的平均直径。 为了避免一些样品中较大的血管比例过高，测量容器中的每个植入位点的数目相同。 3.定性评估采用免疫组化脱蜡和补液 Deparaffinize切片浸入滑动安装在耐热滑架的100％二甲苯浴，在室温下10分钟。 浸入含有清洁二甲苯另外10分钟，在滑动浴。 顺序地浸入载玻片在含有100％的乙醇，95％乙醇和70％，纯化水，每次5分钟浴。 抗原检索制备在纯水中的10 mM柠檬酸钠缓冲液，并调整至pH 6，用10摩尔的盐酸。 填写一个耐热的容器，可以容纳含有足够笏国内压力锅600毫升用400毫升柠檬酸钠缓冲液和地点呃淹没容器的一半。松散地连接高压锅热的盖，直至沸腾。 地方玻片架放入柠檬酸钠缓冲液和紧密固定压力锅的盖上。一旦加压，使沸腾3分钟。 降压压力锅，取出内部容器。允许滑动到在柠檬酸钠缓冲液冷却，在室温下10分钟。 洗幻灯片中含有纯净水5分钟洗澡。 环绕使用疏水性屏障笔的部分。 通过浸没在PBS 5分钟洗幻灯片。 阻断内源性过氧化物酶和非特异性结合孵育3％过氧化氢稀释在纯水中，在湿润的腔室30分钟，在室温下部分。 注意：过氧化氢是强烈刺激眼睛，皮肤和在摄入。穿戴合适的个人防护装备。 挖掘掉多余的过氧化氢溶液和洗涤SLI德两次通过浸没在Tris缓冲盐水（TBS）中，每次2分钟。 孵育小鼠免疫球蛋白封闭试剂从根据制造商的说明制备对小鼠套件鼠标部分。 洗涤滑动两次在TBS中每2分钟。 平滑肌肌动蛋白免疫检测制备抗体稀释液（在试剂盒中提供），并孵育切片5分钟，在室温下，或根据制造商的说明。 稀释1：100的小鼠抗人平滑肌肌动蛋白（DAKO M0851）在抗体稀释液溶液。稀释在抗体稀释溶液小鼠IgG2a同种型对照，以确保最终的免疫球蛋白浓度在两种解决方案等效的。 点击多余的抗体稀释溶液，并覆盖部分与任何稀释的抗体或同种型控制解决方案。孵育在一个加湿室中30分钟，在室温下进行。 洗涤滑动两次在TBS中每2分钟。 稀释生物素化的抗小鼠二抗孵育切片在室温下10分钟，或根据制造商的说明。 洗涤滑动一旦各用TBS和PBS进行2分钟，分别。 根据制造商的说明制备3,3'-二氨基联苯胺（DAB）溶液。顶盖采用DAB溶液部分和孵化长达4分钟，确保监测部分，以避免过多的颜色变化。 注意：DAB是易燃品，可疑致癌物是通过接触和吸入有毒。在处理时应佩戴合适的个人防护装备。 沉浸在纯净水滑梯，一旦染色所需的强度达到。 染液用50％吉尔号3苏木为20秒，并在流动的自来水直到水运行清楚在染色槽清洗。 脱水和安装在通风橱中，依次浸泡在含70％ETH浴场幻灯片anol，95％乙醇和100％乙醇，每次5分钟。 浸入含有二甲苯10分钟洗澡幻灯片。 摩盖玻片用二甲苯基的安装平台。在通风橱中可视化，在显微镜下将载玻片事先干燥水平地和彻底地