外酸生産の測定と解析は、解糖速度を決定するために

1.細胞外フラックス計測器でバッファリングパワー測定：2つのバリエーションを注：ここで説明した計算及び方法は、細胞外フラックスアナライザーを使用して開発されました。他の楽器のために、測定体積は適切にスケーリングされなければなりません。 製造者の指示に従って（材料および機器を参照）塩酸濃縮物を用いて水に0.1 M塩酸標準を準備します。 注：すべての4つの注入ポートにおいて使用するためのHClの注射を調製するための計算例を表1に示します。 細胞外フラックスアッセイに表1連続塩酸注射も。 培地中のHCl標準の希釈液は、カールされる技術的反復の数については、表1のようにアッセイする準備一方のプレートの中でIED、プラスワンは、ピペッティング誤差を許容するために、 例えば 、ポートの4技術的反復注射のために、（48.9μL×5）アッセイ培地（1.1μL×5）、0.1MのHClの株式を準備します。 50μLを測定プローブカートリッジの各ポートAに配布します。残りのポートA、B、C、およびDに、この手順を繰り返し 4ポートの追加のそれぞれについて、[2分ミックス、1分待ち、5分の測定]の2つのサイクルが続く標準較正サイクルを有する細胞外フラックスアッセイ10を実行します（ 図2を参照）。 ソフトウェアの指示に従って機器のソフトウェアで上記実験をプログラム。マシンに準備されたカートリッジをロードして、ソフトウェアの指示に従ってキャリブレーションを行います。 プログラムによってプロンプトが表示されたら、較正物質含有プレートを取り外し、よく機器に各アッセイ培地を含むプレートを挿入します。プログラムを続行します。 U以前から定常状態で得られた8-10データポイント（通常は最後の8-10点）の平均値を歌い、各ポートを添加した後、標準的な酸の各注入によるpH値（ΔPH）中（累計）の差を計算します。 測定プローブに捕捉された7μlのボリュームに含まれるナノモルの H +に対してプロットΔPH。線形勾配はMPH /ピコモルのの H +でバッファリングパワー（BP）です。 あるいはステップ1.2〜1.3に、ポートA、B、及びCは、表2のようにポートD.中のHClの注入に続いて実験を行うために使用される4つの技術的反復であるれるアッセイ以下ΔPHの測定を行います細胞外フラックスアッセイプレート（4背景温度補正ウェルを除く）20実験ウェル中の5点標準曲線の各点を生成するために使用されます。 53464table2.jpg "/> よく細胞外フラックスアッセイに表2.シングル塩酸注入。 2.外部のpHメーターを使用してバッファリングパワーを測定注：外部pHプローブを用いて、培地の緩衝能​​力を測定する、37℃でプローブを校正し、実験の間、すべての試薬について、この温度を維持します。 製造者の指示に従って、塩酸濃縮物を用いて水に0.1 M塩酸標準を準備します。 暖かいpHプローブ、pHが基準、そのバッファリング電力測定するアッセイ培地、及び水浴中で37℃に0.1 MのHCl。 製造者の指示に従って、37℃でのpHプローブを校正。熱板や水浴を使用してアッセイを通して37℃ですべての試薬を維持します。 小さなビーカー又は円錐チューブに小分けし、アッセイ培地10mlを。連続浸漬pHプローブを用いてpHを監視します。 0.1 M HClをように追加10〜20μlのアリコート中の培地を言います。 攪拌棒を使って、または手動で各酸を添加した後、容器を旋回による混合を確認してください。 pH測定のための数秒間は、各添加後のpHを記録した後、安定化させます。 表3に示されているように、正確な傾きの計算を確実にするために、実験中に予想されるpH範囲をカバーするのに十分な数の加算を行います。 表3. pHメーターを使用して、緩衝力を測定した。データを、0.1 M HClを620μlの添加との典型的な実験を表します。 ナノモルH +に対してプロットΔPHは、緩衝力（ 図1）を表し 、線形勾配を与え、7μlのあたりに追加されました。 <p class="jove_content" fo:keep-together.withinページ= "常に"> 図1.バッファリングパワーを決定します 。 HClの標準曲線は 、表3のように、表1、表2または（ここでは）のように測定した。線形曲線適合の傾斜は、緩衝力液（pH /ナノモルのH + 7μlの）を与えます。各点は、n = 9の技術的反復の平均±SEMを表します。 緩衝力は、上記の方法1または2を介して知られると、電源（BP）（MPH /ピコモルのH +）をバッファリングすることによってECARを割ることによってPPR（ピコモルのH + /分/μgタンパク質）にECAR信号（MPH /分）に変換各ウェルのタンパク質含量にスケーリング。 PPRのTOT（ピコモルのH + /分/μgタンパク質）= ECAR（MPH /分）/ BP（MPH /ピコモルのH + 7μLで）ウェル（μgの）あたり/タンパク質式6 あるいは、この方法で同じ実験を使用自動データ収集中にPPRを計算するために機器のソフトウェアによって使用される緩衝能力（BC）の値を計算するための1又は2。 注：機器のユーザーマニュアル12（107ページ）BCは次のように記述されている緩衝能力を計算し、使用方法についての詳細な情報を提供 BC（モル/ L）=モルのH + /（ΔPHXバッファ容量（L）） 式7 注：式7で定義された緩衝能力は、機器又は上記の外部pHプローブアッセイで算出することができます。バッファリングパワーと緩衝能の間の変換を簡単に（添付のスプレッドシートを参照してください）​​行われます。 BC = 1×10 -9 / BP（（MPH /ピコモルのH + 7μLで）/ 7μl）を式（8） 注：アッセイを行う前に知られている場合は、緩衝能力が実験中の機器のソフトウェアに直接入力することができます。 以前の刊行物6に記載のように 、この手順とほとんどの従来の緩衝系を使用する上記の計算を適用します。 注： 表4の緩衝力といくつかの従来の媒体の緩衝能力。 表4.バッファリングパワーと選択したメディアの緩衝能力。 3. C2C12筋芽細胞を用いた細胞外フラックスアッセイを行います注： – + Hステップ3.4.3において、CO 2には観察された差はなかったその存在がHCO 3にCO 2の完全な変換に必要とされないことを示唆し、C2C12培養での炭酸脱水酵素の存在に依存酸生産を由来+。しかし、経験的に異なる実験系でこれをテストする前にOMをお勧めしますitting炭酸脱水酵素。 培養マウスC2C12 11.1 mMグルコース、2mMのグルタミン、10％v / vのウシ胎児血清（FBS）、100 Uを有するダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中、95％空気/ 5％CO 2下、37℃で13筋芽細胞/ mlのペニシリンおよび100μg/ mlのストレプトマイシン。 24時間アッセイの前に、20,000細胞で同じ培養培地100μlでプレート/シード細胞/ウェルでなし追加のコーティングを含む24ウェルポリスチレン細胞外フラックスアッセイプレート（材料及び方法を参照）。 クレブスリンガーリン酸、HEPES（KRPH）アッセイ培地（2 mMのHEPES、136mMの塩化ナトリウム、2mMののNaH 2 PO 4、3.7 mMのKClを、1で10倍の最終濃度になるように、FCCPをオリゴ希釈し、ロテノンプラスmyxothiazol、およびHCl（オプション） mMのMgCl 2を、37℃で1.5ミリモルのCaCl 2、0.1％w / vの脂肪酸不含ウシ血清アルブミン、pH7.4中）。 細胞調製アッセイの前に30分、GEに吸引することにより、接着細胞を3回洗浄ntlyウェルから培地を除去した後、ゆっくりと500μlのKRPHを追加。 （この重炭酸塩を含まない培地のpHを変えるわけではない、5％CO 2下で、）、37℃空気中での3回目の洗浄工程の後、細胞をインキュベートします。 アッセイ開始時には、追加の基板を、500 U / mlの炭酸脱水酵素とグルコース（10 mM）のまたは中のいずれかのみを含む500μlの新鮮なKRPHでウェルにKRPHを交換してください。 センサカートリッジのロードポートA：2 / mlのオリゴマイシン、ポートB：0.5μMFCCP、ポートC（アッセイにおける最終濃度が十分に与えられた）、次のように細胞外フラックスセンサカートリッジのカートリッジポートにステップ3.3で調製した各10倍化合物のピペットで50μlのアリコート：1μMロテノン、1μMのmyxothiazol、ポートD：塩酸（上記および表2に記載されているようでアッセイ酸キャリブレーションを行う場合）。 注：ここで説明する完全な呼吸鎖阻害の目的のために、1μMの私xothiazol 1μMのアンチマイシンAと交換可能に使用することができます細胞外フラックスアッセイ： 10に記載の呼吸制御を決定するための標準的な細胞外フラックスアッセイを行います。 注：実験の各セグメントについては、ミックスを決定し、待って、測定時間が必要なだけでなく、セグメント当たりのサイクル数。 注： 表5のデータは、3アッセイサイクルはバッファリングのキャリブレーションのためのHCl（量の異なるポートDを添加した後に発生すると、2分ミックス、1分待ち、および各セグメントの5分の2つの測定アッセイサイクルにわたって収集しました表2のようにパワー）。 表5.細胞外フラックスアッセイ構成。 4. MeasuriNGエンドポイント乳酸濃度注：の減少（2分かけて）初期速度を測定することにより、従来の96ウェルプレート中で直接決定することができる細胞外フラックス実験の終わりにいくつかの異なるシステム、エンドポイントの乳酸濃度でここに記載の間接アッセイを検証しますNAD +→NADHは、事前の出版物6に詳細に記載さ乳酸脱水素酵素によって触媒。代表的な結果に示されたデータは、グルコース含有アッセイウェル内のエンドポイントの乳酸濃度は〜40μmでした。 2倍ヒドラジン媒体を準備し、1Mのトリス、20mMのEDTA、400mMのヒドラジン、22℃でのpHは9.8）。すぐにアッセイ開始前に、40 U / mlに4ミリ、乳酸脱水素酵素（LDH）にNAD + を追加します 。最終的なアッセイ培地組成物（1×）：500 mMトリス、10mMのEDTA、200mMのヒドラジン、2 mMのNAD +、20 U / mLのLDH。 すぐに細胞外フラックスアッセイ以下、100を削除します細胞外フラックスアッセイプレートの各ウェルからアッセイ培地μlの不透明（黒色）を、96ウェルプレートのウェルに移します。 各サンプルウェルに、100μlの2倍ヒドラジン媒体を追加します。 直ちにマイクロプレートリーダーにプレートをロードし、340 nm励起/ 460 nm発光でNADH蛍光の監視を開始。 約2分間の初期速度を記録します。 0〜50μMの追加乳酸濃度についての乳酸濃度に対する初期速度をプロットすることにより標準曲線を構築するために同様の実験を実行します。 標準曲線を用いて、各ウェルの実験中の乳酸濃度を計算します。 5.タンパク質含有量を測定しますアッセイプレートの各ウェルから残りのアッセイ培地を除去します。 底のウェル表面から細胞の脱落を最小限に抑えるように注意しながら、BSAフリーKRPHμlの250でウェルを3回洗浄します。 25μlのRIPA溶解を追加培地（150mMのNaCl、50mMのトリス、1mMのEGTA、1mMのEDTA、1％v / vのトリトンX-100、0.5％w / vのデオキシコール酸ナトリウム、0.1％v / vのSDS、22℃でpH7.4）中アッセイプレートの各ウェルに。 氷上で30分間、プレートをインキュベートします。 5分間1200 rpmでプレートシェーカー上でプレートを撹拌します。 溶解緩衝液組成物は、測定方法に対応していることを確認して、BCAアッセイにより、例えば 、標準的な方法によりタンパク質濃度を測定します。 図2の実験中のタンパク質含量/ウェル〜4μgのでした。