Meting en analyse van de extracellulaire zuurproductie te bepalen glycolytisch Rate

1. Meten Buffering Macht in een extracellulaire Flux Instrument: Twee Variaties OPMERKING: de berekeningen en methoden hier beschreven werden ontwikkeld met behulp van een extracellulaire Flux Analyzer. Voor de andere instrumenten, moet de meting volume op passende wijze worden geschaald. Bereid 0,1 M standaard HCl in water met behulp van HCl concentraat (zie materialen en apparatuur) volgens de instructies van de fabrikant. Opmerking: Een rekenvoorbeeld voorbereidende HCl injecties voor gebruik in alle vier injectieopeningen is weergegeven in tabel 1: Tabel 1. Opeenvolgende HCl injecties in een extracellulaire flux test goed. Bereid verdunningen van het HCl standaard in het medium te worden getest zoals in tabel 1 voor het aantal technische repliceert dat Carried in één plaat, plus één toe te staan ​​voor het pipetteren fout, bijvoorbeeld voor vier technische replica van de haven Een injectie, bereiden een voorraad (1,1 pi x 5) 0,1 M HCl in (48,9 pi x 5) test medium. Verdeel 50 ul in elk poort A van de meting sonde cartridge. Herhaal deze procedure voor overige poorten B, C en D. Run een extracellulair flux assay 10 met een standaard kalibratie cyclus, gevolgd door twee cycli van [2 min mix, 1 min wachten, en 5 min meten] voor elk van de vier poort toevoegingen (zie figuur 2). Programmeer het experiment boven in het instrument software volgens de instructies van de software. Laad de voorbereide cartridge in de machine en voer de kalibratie volgens de software-instructies. Wanneer u wordt gevraagd door het programma, verwijder de-kalibrant met plaat en plaats de plaat met test medium in elk putje in het instrument; het programma voort. U zingen het gemiddelde van 8-10 gegevenspunten verkregen bij steady state (meestal de laatste 8-10 punten) van voor en na elke haven Bovendien berekent de (cumulatief) verschil in pH (ApH) veroorzaakt door elke injectie zuur di. Plot ApH tegen nmol H + in de 7 pl volume gevangen door de meetsonde. De lineaire helling is de buffering vermogen (BP) in mph / pmol H +. Alternatief stappen 1,2-1,3, voeren de ApH metingen na een test waarin poorten A, B en C worden gebruikt voor het uitvoeren van een experiment, gevolgd door een injectie HCl in Port D. Zoals in tabel 2, zijn vier technische repliceert gebruikt om elk punt van een 5-punts standaardcurve in het 20 experimentele putjes (exclusief de vier achtergrond temperatuurcorrectie putjes) van de extracellulaire flux testplaat genereren. 53464table2.jpg "/> Tabel 2. Single HCl injectie in een extracellulaire flux test goed. 2. Meten buffer vermogen Gebruik van een externe pH Meter Opmerking: Om de buffer kracht van een medium een ​​externe pH-sonde meet, kalibreert de sonde bij 37 ° C en deze temperatuur gedurende alle reagentia tijdens het experiment te handhaven. Bereid 0,1 M standaard HCl in water met behulp van HCl concentraat volgens instructies van de fabrikant. Warm pH sonde, pH normen, het testmedium waarvan buffering vermogen wordt gemeten, en 0,1 M HCl tot 37 ° C in een waterbad. Kalibreer pH-probe bij 37 ° C volgens de instructies van de fabrikant. Handhaaf alle reagentia bij 37 ° C gedurende de test met behulp van een warmteplaat of waterbad. Aliquot 10 ml van de voedingsbodem in een kleine beker of conische buis. Monitor pH continu met behulp van een ondergedompeld pH-sonde. Voeg 0,1 M HCI om het alszeggen medium in 10-20 pl porties. Zorgen voor het mengen met behulp van een roerstaafje of door het handmatig wervelende de container na elke zuur toevoeging. Wacht een paar seconden voor de pH-meting te stabiliseren, dan nemen de pH na elke toevoeging. Zoals aangetoond in Tabel 3, maakt een voldoende aanvullingen op nauwkeurige helling berekening waarborgen en de pH verwacht tijdens het experiment te dekken. Tabel 3. Meten buffering energiegebruikende een pH-meter. De gegevens geven een typisch experiment zes 20 gl toevoegingen van 0,1 M HCl. Plot ApH tegen nmol H + toegevoegd per 7 pl, waardoor een lineaire helling die de bufferende vermogen (figuur 1) representeert. <p class="jove_content" fo:keep-together.binnen-page = "always"> Figuur 1. Bepalen buffering macht. HCl standaardkromme gemeten zoals in Tabel 1, Tabel 2 of (hier) zoals in tabel 3. De helling van de lineaire curve fit geeft het bufferende vermogen (pH / nmol H + in 7 ui). Elk punt staat gemiddelde ± SEM van n = 9 technische herhalingen. Zodra de buffering stroom is bekend door middel van methode 1 of 2 hierboven, zet de ECAR signaal (mijl / min) naar PPR (pmol H + / min / ug eiwit) door te delen ECAR door buffering vermogen (BP) (mijl / pmol H +) en schalen om het eiwitgehalte van elk putje: PPR tot (pmol H + / min / ug eiwit) = ECAR (mijl / min) / BP (mijl / pmol H + in 7 pl) / eiwit per putje (ug) Vergelijking 6 U kunt ook gebruik maken van dezelfde experimenten in methodes 1 of 2 om de buffercapaciteit (BC) waarde die door het instrument software berekent automatisch PPR tijdens het verzamelen van gegevens te berekenen. NB: Het instrument handleiding 12 (pagina 107) geeft gedetailleerde informatie over het berekenen en het gebruik van buffercapaciteit, waarbij BC wordt beschreven als BC (mol / L) = mol H + / (ApH x buffer volume (L)) Vergelijking 7 Opmerking: De buffercapaciteit zoals gedefinieerd in vergelijking 7 kan worden berekend in het instrument of externe pH-probe die hierboven is beschreven. Conversie tussen buffering macht en buffercapaciteit is eenvoudig te doen (zie bijgevoegde spreadsheet): BC = 1 x 10 -9 / BP ((mijl / pmol H + in 7 pl) / 7 pl) Vergelijking 8 LET OP: Als bekend voorafgaand aan het uitvoeren van de test, de buffercapaciteit kan worden rechtstreeks in de software instrument tijdens de experimentele opstelling ingevoerd. Breng deze procedure en de bovenstaande berekeningen gebruikt om de meeste gebruikelijke buffersystemen, zoals beschreven in voorgaande publicatie 6. OPMERKING: Tabel 4 somt de buffering kracht en de buffercapaciteit van verschillende conventionele media. Tabel 4. buffer kracht en de buffercapaciteit van de geselecteerde media. 3. Het uitvoeren van een extracellulaire Flux Bepaling gebruiken C2C12 myoblastcellen Opmerking: In stap 3.4.3, waren er geen verschillen waargenomen in CO 2 -afgeleide zuurproductie afhankelijk van de aanwezigheid van koolzuuranhydrase in C2C12 cultuur, wat suggereert dat de aanwezigheid niet vereist voor volledige omzetting van CO 2 tot HCO 3 – + H +. Echter, empirisch deze testen in verschillende experimentele systemen wordt aanbevolen voor het OMitting koolzuuranhydrase. Culture muis C2C12-myoblasten 13 bij 37 ° C onder 95% lucht / 5% CO2 in Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium (DMEM) met 11,1 mM glucose, 2 mM glutamine, 10% v / v foetaal runderserum (FBS), 100 U / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine. 24 uur voorafgaande aan assay plaat / zaadcellen in 100 ul van hetzelfde kweekmedium bij 20.000 cellen / putje in een 24-well polystyreen extracellulaire flux testplaat (zie Materialen en Werkwijzen) zonder extra coating. Verdunnen oligomycin, FCCP en rotenone plus myxothiazol en HCl (optioneel) tot 10x uiteindelijke concentratie in Krebs Ringer Fosfaat HEPES (KRPH) test medium (2 mM HEPES, 136 mM NaCl, 2 mM NaH 2 PO 4, 3,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1,5 mM CaCl2, 0,1% w / v vetzuur-vrij runderserumalbumine, pH 7,4 bij 37 ° C). Celpreparaat 30 min vóór de test was hechtende cellen drie keer door opzuigen om gently Verwijder het medium uit de put en dan langzaam toevoegen van 500 pi KRPH. Incubeer cellen na de derde wasstap bij 37 ° C onder lucht (niet bij 5% CO2, waarbij de pH van het bicarbonaat-vrij medium zal veranderen). Bij test start, vervang KRPH in putjes met 500 ui verse KRPH met 500 U / ml koolzuuranhydrase en ofwel glucose (10 mm) of alleen medium, zonder extra substraat. Laden van de sensorcartridge Pipet 50 ul porties van elk 10x verbinding bereid in stap 3.3 in de cartridge havens van een extracellulaire flux sensorcartridge als volgt (uiteindelijke concentraties in de test goed gegeven): Poort A: 2 ug / ml oligomycin, Port B: 0,5 uM FCCP, Port C : 1 uM rotenon, 1 uM myxothiazol, Port D: HCl (als het uitvoeren van een in-assay zuur calibratie zoals hierboven en in tabel 2 beschreven). NB: voor het doel van volledige respiratoire keten remming hier beschreven, 1 uM mijnxothiazol kunnen onderling verwisseld worden met 1 uM antimycin A. Extracellulaire flux test: Voer een standaard extracellulaire flux gekwantificeerd door respiratoire controle zoals beschreven in 10. Opmerking: Voor elk segment van het experiment, bepalen de mix, wacht en meettijden gewenst, evenals het aantal cycli per segment. Opmerking: De gegevens in Tabel 5 werden verzameld gedurende twee assay cycli 2 min mix, 1 min wachten, en 5 min maat voor elk segment, drie assay cycli optreedt na het poort D toevoeging van verschillende hoeveelheden HCl (kalibratie bufferen macht zoals in tabel 2). Tabel 5. Extracellulaire flux assay configuratie. 4. Measuring End-point lactaatconcentratie Opmerking: De indirecte assay beschreven in een aantal verschillende systeem eindpunt lactaat concentratie aan het einde van een extracellulair flux experiment kan direct in een gebruikelijke 96-putjesplaat worden bepaald valideren door het meten van de initiële snelheid (meer dan 2 min) vermindering van NAD + NADH → gekatalyseerd door lactaatdehydrogenase, in detail beschreven in onze eerdere publicatie 6. Voor de gepresenteerde in Representatieve resultaten van gegevens, het eindpunt lactaatconcentratie in glucose bevattend test putten was ~ 40 uM. Bereid 2x hydrazine medium: 1 M Tris, 20 mM EDTA, 400 mM hydrazine, pH 9,8 bij 22 ° C). Onmiddellijk voor assay start, voeg NAD + tot 4 mM en lactaat dehydrogenase (LDH) met 40 U / ml. Uiteindelijke testmedium samenstelling (1x): 500 mM Tris, 10 mM EDTA, 200 mM hydrazine, 2 mM NAD +, 20 U / ml LDH. Onmiddellijk na de extracellulaire flux test, verwijder 100pl assay medium uit elk putje van de extracellulaire flux testplaat overgebracht in een putje van een ondoorzichtige (zwart) 96-wells plaat. Aan elk monster goed, voeg 100 ul 2x hydrazine medium. Onmiddellijk laden van de plaat in een microplaataflezer en beginnen met het toezicht op NADH fluorescentie bij 340 nm excitatie / 460 nm emissie. Noteer de initiële snelheid gedurende ongeveer 2 min. Voer een soortgelijk experiment met een standaardkromme te construeren door het uitzetten van de initiële snelheid tegen de lactaat concentratie toegevoegd lactaatconcentraties vanaf 0 tot 50 uM. Bereken lactaatconcentratie in elke experimentele goed gebruik van de standaard curve. 5. Het meten van het eiwitgehalte Verwijder resterende test medium uit elk putje van de testplaat. Was putjes drie keer met 250 ul-BSA vrije KRPH, voorzichtig om het loskomen van de cellen van de bodem en het oppervlak te minimaliseren. Voeg 25 ul RIPA lysismedium (150 mM NaCl, 50 mM Tris, 1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 1% v / v Triton X-100, 0,5% w / v natrium deoxycholaat, 0,1% v / v SDS, pH 7,4 bij 22 ° C) aan elk putje van de testplaat. Incubeer plaat op ijs gedurende 30 min. Schud plaat op een plaat schudder bij 1200 rpm gedurende 5 min. Meet eiwitconcentratie met standaardmethoden, bijvoorbeeld door BCA assay, zodat de lysisbuffer samenstelling verenigbaar is met de meetmethode. Het eiwitgehalte in het experiment in Figuur 2 is ~ 4 ug / putje.