Sequentiële extractie van oplosbare en onoplosbare Alpha-Synuclein van Parkinson Brains

Post-mortem hersenweefsel werd geschonken aan Queen Square Brain Bank voor neurologische aandoeningen, University College London, Instituut voor Neurologie gebruik ethisch goedgekeurde protocollen en opgeslagen voor onderzoek onder een vergunning van het menselijk weefsel autoriteit (HTA) Groot-Brittannië (nr. 12198). Zie de lijst van de gevallen gebruikt voor dit protocol (Tabel 1). 1. Bereiding van Buffers Bereid 1X TBS (Tris-gebufferde zoutoplossing) buffer: Bereid 10X TBS als voorraadoplossing met 500 mM Tris-HCl pH 7,4 en 1500 mM NaCl. Weeg 60,5 g Tris-Cl pH 7,6 en 87,6 g NaCl in 800 ml zuiver water. Stel de pH met 1 M HCl en de uiteindelijke voorraad volume tot 1 L. Bereid de uiteindelijke concentratie van 1X TBS door verdunning van de stock 10 keer in gedestilleerd water. Voeg proteaseremmers (PI), (1 tablet per 50 ml buffer) en Phos-stop fosfataseremmer tabletten (1 tablet per 10 ml buffer) aantrekt hij de effecten van niet-specifieke enzymatische werking van proteasen en fosfatasen. Opmerking: Hier hebben we het enzym remmer tabletten uit Roche maar ook andere commercieel verkrijgbare remmers kunnen worden gebruikt volgens de instructies van de fabrikant gebruikt. Bereid TBS-SDS-buffer door het toevoegen van 5% g / v natrium dodecyl sulfaat (SDS) aan 1X TBS (pH 7,4) buffer. Verwarm de oplossing tot 60 ° C onder constant roeren met een magnetische roerder te solubiliseren SDS. Bereid TBS-SDS-ureum buffer door ureum toe te voegen tot een eindconcentratie van 8 M w / v tot 1X TBS-SDS-buffer (pH 7,4). Verwarm de oplossing tot 60 ° C onder constant roeren op een magnetische roerder ureum lossen. 2. Steekproef homogenisering en Differential Ultracentrifugatie Opmerking: De volgende deel van het werk omvat de behandeling van het menselijk hersenweefsel volgens de regels van de HTA UK. Lokale standaard operationele procedures worden gevolgd op alle times. Brain monsters worden ontleed uit bevroren hersenen blokkeert en weefsel materiaal gehomogeniseerd in een microcabinet gehandhaafd op negatieve druk. Wegwerp jassen handschoenen, face-maskers, over-schoen beschermers en een veiligheidsbril worden gedragen tijdens de gehele procedure. Menselijk weefsel afval wordt na autoclaaf bij 121 ° C gedurende 20 minuten voor een veilige verwijdering weggegooid. Sharps (scalpelmesjes) worden aangebracht in een daarvoor bestemde container voor insluiting en veilige verwijdering. Neem een stuk van bevroren menselijk weefsel (ongeveer 0,5 g gewicht van de basale ganglia regio) en snel gehakt in kleine fragmenten (ongeveer 1 mm 2) op het ijs met een kleine petrischaal en een steriel scalpel. Gebruik een afzonderlijke petrischaal en scalpel voor elk monster. Verzamel de gemalen weefsel in een 15 ml buis en voeg 10 volumina ijskoude 1XTBS buffer aan de buis. Homogeniseer de monsters onder toepassing van een mechanische homogenisator bij 20000 rpm gedurende 10 sec. Koelen op ijs gedurende 2 minuten. Herhaal deze stap drie keers. Opmerking: Dit wordt gedaan zodat de monsters niet worden opgewarmd onder homogeniseren. Verhelderen door centrifugering bij 1000 g gedurende 5 min bij 4 ° C. Gooi pellet van niet-gehomogeniseerde materiaal. Neem supernatant (ruw homogenaat), toe te voegen aan centrifugebuizen (grootte van de buis hangt af van de grootte van de rotor) polycarbonaat en het evenwicht zorgvuldig. Centrifugeer bij 100.000 xg gedurende 1 uur bij 4 ° C. Bewaar bovenstaande vloeistof aangezien dit de TBS-oplosbare fractie. Was de pellet twee keer in vijf volumes 1X TBS buffer en centrifugeer telkens bij 100.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C. Gooi de supernatanten. Resuspendeer de uiteindelijke pellet door sonicatie de pellet gedurende 10 sec bij 20 KHz ongeveer 5 volumes 1X TBS-SDS bij kamertemperatuur. Opmerking: Voor toevoeging van de SDS bevattende buffer monsters bij 10 ° C worden gebracht VIB neerslaan te voorkomen. Ultracentrifuge bij 100.000 xg gedurende 30 min bij 25 ° C. Bewaar bovenstaande vloeistof aangezien dit the SDS oplosbare fractie. Was pellet tweemaal in 5 volumes 1X TBS-SDS-buffer bij kamertemperatuur. Centrifugeer telkens bij 100.000 xg gedurende 15 min bij 25 ° C. Oplosbaar de uiteindelijke pellet in 50 pl 1X TBS-SDS-buffer UREUM met een sonicator ingesteld op 20 kHz gedurende 10 seconden om volledige solubilisatie bereiken; Dit wordt genoemd het ureum oplosbare fractie. Testen elke fractie voor totale eiwitgehalte onder toepassing van een commercieel eiwit assay kit volgens protocol van de fabrikant. Verdun TBS-SDS-ureum monsters 1: 1 met 1X TBS buffer verenigbaarheid met proteïne assay reagens mogelijk maken. Freeze monsters in kleine porties (20 pl) bij -80 ° C aan vries-dooi cycli verminderen. Opmerking: Het toevoegen van 10% glycerol monsters wordt aanbevolen voor langdurige opslag bij -80 ° C. 3. Immunoblotting van monsters en het analyseren van resultaten Lopen monsters van TBS, TBS-SDS en TBS-SDS-Urea extracten op 10-put 4-12% Bis-Tris polyacrylamidegelmet MOPS als loopbuffer met standaardtechnieken. Zie Gallagher en Chakravarti (2008) 29 voor een gedetailleerde western blot protocol. Belasting 10 ug eiwit uit elk monster in elke rij met een molecuulgewicht marker voor TBS en SDS en ureum fracties. Run gel bij 200 V gedurende 1 uur of totdat de blauwe kleurstof uit laadbuffer heeft de bodem van de gel bereikte. Transfer van eiwitten gels elektroforetisch naar nylon membranen 28, eerst in 100% methanol en daarna vooraf bevochtigd in overdrachtbuffer bevattende 20% methanol. Geef een identificatiemerkteken op de blot om het eiwit kant en de oriëntatie van het molecuulgewicht size markers. Sandwich de gel met het membraan langs natte papieren filter. Correcte plaatsing van het membraan essentieel met het membraan tussen de gel en de anode. Voer de transfer voor 2 uur bij 40 V. Make up 1X PBS-tween (1X PBS-T) buffer: Los 1 tablet van PBS in 200 mlwater 0,01 M fosfaatbuffer, 0,0027 M kaliumchloride en 0,137 M natriumchloride, pH 7,4 verkregen. Blokkeer het membraan in 5% BSA-oplossing in 1 x PBS-T gedurende 30 min met schudden bij 70 rpm. Dit voorkomt niet-specifieke binding van primair antilichaam aan het membraan. Probe het eiwit blot met 6 ml α-syn primair antilichaam Syn-1 (BD Biosciences, muis monoklonaal antilichaam) bij 1: 750 verdunning (O / N bij 4 ° C), gevolgd door een reeks wassingen met 1 x PBS-T ( 3 x 5 min per keer) 28. Incubeer de vlek met de geschikte HRP geconjugeerd secundair antilichaam bij 1: 2000 verdunning gedurende 30 min. Voer een reeks wassingen (3 x 5 min per keer) met 1 x PBS-T. Dompel blots in versterkte chemiluminescentie oplossing 15 seconden in een donkere kamer. Cover vlekken met een plastic folie en plaats autoradiografie films tegen de vlek met eiwit kant naar boven in een lichtdichte cassette naar de juiste signalen (juiste grootte bands) vast te leggen. Ontwikkelen autoradiografie films in een geautomatiseerd ontwikkelaar. Opmerking: Vlekken kunnen ook handmatig worden ontwikkeld met behulp van ontwikkelaar en fixeer van een commerciële bron in het geval van een automatische ontwikkelaar machine is niet beschikbaar. Incubeer de western blot met 6 ml van western blot strippen buffer gedurende 10 min met een constante schudden om de vlek van α-syn antilichaam signaal strippen. Volg de stappen 3.43 tot en met 3.6.2 met behulp van beta-actine primaire antilichaam (muis monoklonaal) op 1: 8000 verdunning. Scannen en converteren van de laatste afbeelding in een Tiff beeld en de maatregel dichtheden met behulp van NIH ImageJ voor kwantificering doeleinden (een gratis te downloaden software). Opmerking: De software maakt het lezen van dichtheden van relatieve interessegebied (de juiste grootte groepen) en de gegevens worden uitgedrukt als een verhouding van α-syn density / β-actine (a-huishoudgen gen) als willekeurige eenheden of zijn recht wanneer een huishoudpersoneel gen niet geldig (zoals in het geval van ureum oplosbare samples). </li>