Оптимизация раны царапинам анализе для обнаружения изменений в мышиной мезенхимальных стромальных клеток миграции после повреждения по растворимый экстракт сигаретного дыма

Миграция клеток высоко скоординированных и жизненно важное значение для многих физиологических процессах, таких как развитие тканей, ремонта и регенерации, а также патологических процессов, таких как метастазирование рака и атеросклероза ^1. Понимание миграции клеток, в частности, отношение к возникающим лечения, используемых для восстановления поврежденных тканей и лечения патологических состояний, в том числе клеточной трансплантации и искусственных технологий ткани прививки ^2. Учитывая текущую заинтересованность в роли мезенхимальных стромальных клеток (МСК) в опосредовании тканей ремонт ^3, количественной миграционную способность этих клеток с помощью анализа, который строго количественно, адаптации, и экономически эффективным представляет интерес. Важно отметить, что подобный анализ должен быть достаточно чувствительным, чтобы обнаружить относительно небольшие изменения в клеточной миграции емкости после повреждения. Современные методы количественной оценки миграции клеток, в том числе скретч-анализы, анализы миграции транс-а (Бойден чянтарь), micropillar массивы, и анализы клеточной зоны отчуждения обладают ряд ограничений в воспроизводимости, возможности настройки, количественного и экономической эффективности ^1,4,5. Оптимизированная царапины анализа, описанного здесь демонстрирует устойчивые результаты, поддающиеся количественной оценке и на основе образа возможности анализа, рентабельность и адаптируемость к другим приложениям.

Царапины анализы были использованы в нескольких емкостей для оценки миграции клеток и пролиферации при различных экспериментальных условиях ^5. Анализ влечет за собой посева назначенных клетки, растет их полное или почти полное слияние, и царапин полученной монослой стерильной иглой или кончиком пипетки ^6. Анализ наиболее часто выполняется путем сравнения ширины царапины над различные моменты времени в случайно выбранных местах ^7-9. Несмотря на видном использования, царапины Анализ посрамлены проблем с воспроизводимостью и количественного определения. Изменчивостьпоколение нуля не только изменяет микроокружение клеток, но также может препятствовать миграции клеток, повреждая поверхности пластины и основной внеклеточный ^{матрикс-5.} Анализы часто проводились в течение 7 до 12 часов, однако для клеточных линий отображаются медленнее и дольше миграции раз анализ, распространение становится сбивающий переменной ^7,10. Наконец, стареющие клетки, созданные в процессе царапин может выпустить факторы, которые мешают внеклеточной сигнализации требуется, чтобы закрыть разрыв в монослое ^1. Оптимизация царапинам анализа требует создания постоянной щели, чтобы не мешать с поверхностными свойствами, минимизируя длительность анализа и предупреждения нежелательной клеточной гибели во время манипуляции. Пробка на основе анализа является оптимизация зоны анализа клеток исключения. Этот анализ используют пробку помещают в середине скважины, что исключает рост клеток, но позволяет клеткам быть покрыты вокруг центральной зоны отчуждения.Для оценки миграции, стопор снимается, и полученный в результате зона отчуждения обеспечивает поверхность для миграции происходит. Тем не менее, этот анализ сложно настроить или адаптировать ^{10 и} для некоторых приложений, этот метод также может быть сопряжено с запретом.

В отличие от нуля анализов и их производных, миграции и транс-анализов (или Бойдена камеры анализов) оценки миграции путем количественного определения количества клеток, которые перемещаются из одной камеры, через микропористой мембраны фильтра, в камеру, содержащую хемотаксические агентов ^{8,11, 12.} Эта техника имеет ограниченную полезность по адгезивных клеток, таких как МСК, так как следующие миграции через пористую мембрану, клетки прилипать к стороне мембраны воздействию хемотаксиса агентов, и может быть трудно точно измерить. В то время как анализ способен исследовать некоторые трехмерные модели миграции, ограниченные типы клеток, для которых она способна точно определить их миграции клеток ограничивают ее полезность ¹⁰, Еще одной альтернативой нуля анализов использует массив микро-столб, который измеряет сотовой моторику через трехмерном пространстве с помощью способность клеток к деформации и мигрируют в массив в качестве суррогата. Polydimethlysiloxane (PDMS) эластомеры вылечить более точного форму и обрабатывают озоном и фибронектин производит однородную и неразлагаемую микросреду. Расстояние между микро-колонна также может изменяться по мере необходимости, чтобы оценить способность клеток, чтобы войти в массив ^4. Форма создается с помощью глубокой реактивного ионного травления кремниевых пластин для создания отрицательного версию высокого удлинения массива ^13. В то время как анализ подкрепляется его настраиваемость, возможность моделировать трехмерную миграцию и анализ через прямой визуализации мигрирующих клеток, трудности в создании микро-столба массивы экономически препятствует его широкому использованию.

Оптимизированная царапины анализа, описанного в этом протоколе обеспечивает эффективное, созт эффективное Способ получения в соответствии царапины, которые могут быть проанализированы с использованием свободно доступного программного обеспечения. Вместо простых измерений ширины по всей нуля до и после миграции клеток, программное обеспечение позволяет пользователю определить общей площади царапины до и после миграции. Это продвижение ограничивает вопрос, пытаясь определить, где царапина ширина измерения должны быть приняты, и будет ли ширина царапины однородно вдоль его длины. Кроме того, тщательное оптимизацию количества клеток, клеток слияния и типа и степени ущерба, нанесенного клеток обсуждается в целях дальнейшей оптимизации анализа.