I materiali biomimetici per caratterizzare le interazioni batteri-ospite

1. chimica Accoppiamento di proteine ​​per Beads Polymer Accoppiatore direzionale tiolo-ammina Nota: Questo protocollo è adatto per l'accoppiamento di cisteina contenenti proteine ​​ammina-funzionalizzati perle di polimero, utilizzando Sulfosuccinimidyl 4- (p -maleimidophenyl) butirrato (solfo-SMPB) come agente reticolante (Figura 1). Figura 1. reticolazione strategia utilizzata per l'accoppiamento direzionale tiolo-ammina di proteine ​​di perle di polimero. Perle di polistirene Amine modificati vengono attivati ​​con Sulfo-SMPB. Il maleimmide reagisce con cisteine ​​libere per direzionalmente paio di proteine ​​per perline. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Preparazione dei reagenti: Preparare PBS (100 mM sodio fosfato, NaCl 150 mM, pH 7,0) e autoclave. </li> Preparare uno stock 100x (0,5 M o 287 mg / ml in PBS) di TCEP (tris (2-carbossietil) fosfina) immediatamente prima dell'uso. Preparare uno stock 5x (10 mM o 4.58 mg / ml in dH 2 O) di solfo-SMPB immediatamente prima dell'uso. Preparare uno stock 10x (500 mm o 88 mg / ml in PBS, pH 7,0) di cisteina immediatamente prima dell'uso. Attivazione Bead: Mescolare sferette capovolgendo delicatamente e trasferire la quantità necessaria di sferette (ad esempio, 12 ml) in una provetta sterile da 1.5 ml contenente 1 ml di PBS sterile, pH 7,0. Pipettare delicatamente su e giù per lavare le perline e pellet per centrifugazione in una microcentrifuga (2 min a 16.000 xg). Rimuovere con attenzione il surnatante con una pipetta e scartare. Risospendere il pellet tallone in 1 ml di PBS sterile fresca e ripetere la fase di lavaggio. Risospendere il pellet tallone in 0,8 ml di PBS. Aggiungere 200 ml di preparati al momento 10 mM Sulfo-SMPB, per dare un concent finalerazione di 2 mm. Incubare la sospensione di sferette per 1 ora a 25 ° C su una ruota girevole. Riduzione Proteine: Durante il periodo di incubazione della fase di attivazione, preparare la proteina per la successiva fase di accoppiamento in modo che possa essere immediatamente aggiunto ai talloni attivati. Nota: Sebbene questo passaggio riduzione non è sempre necessaria per GST (glutatione S-transferasi) proteine ​​di fusione, si raccomanda di garantire una elevata efficienza di accoppiamento. Controllare la concentrazione di proteine, e regolarlo alla concentrazione finale richiesta per la reazione di accoppiamento. Nota: proteine ​​6 mM in PBS, e un volume di 1 ml di solito vengono utilizzati. Aggiungi TCEP magazzino per dare una concentrazione finale di 5 mm. Incubare la soluzione per 30 minuti a RT. Nota: La miscela di reazione può essere utilizzato direttamente per la reazione di accoppiamento. Mantenere una piccola quantità (pochi ml) della soluzione di proteine ​​per la determinazione del pro la concentrazione TEIN e calcolo di efficienza di accoppiamento (vedi capitolo 2). Proteine ​​fase di accoppiamento: Pellet le perline attivate mediante centrifugazione (2 min, 16.000 xg in una microcentrifuga), e lavare il pellet volta in 1 ml di PBS sterile fresca. Risospendere il pellet in soluzione proteica preparato (per esempio, 1 ml), per ottenere la concentrazione proteina desiderata. Nota: La concentrazione proteica durante la fase di accoppiamento dipende dalla efficienza di accoppiamento medio (vedere sezione 2 per determinare l'efficienza di accoppiamento) e la densità di accoppiamento desiderato (calcolato a 1.1.4.3). L'efficienza è di circa 85% e la desiderata concentrazione finale 5 mM nella sospensione 10x tallone, in modo concentrazione proteica durante la fase di accoppiamento deve essere di circa 6 mm. Calcolare la densità di accoppiamento utilizzando la seguente formula: jpg "/> dove ρ c densità accoppiamento [numero di molecole proteiche / nm 2], proteina concentrazione proteica conc [mg / ml], proteina M w peso molecolare delle proteine ​​[Da], concentrazione tallone conc tallone [numero di perline / L], diametro d tallone [nm 2] Numero di Avogadro Utilizzare la densità di accoppiamento per calcolare la distanza media legante: Incubare la sospensione della proteina-tallone per 2 ore a 25 ° C su una ruota girevole. Nota: alcuniproteine ​​possono non essere stabile a temperatura ambiente. In questi casi, la reazione può essere condotta a 4 ° CO / N. Disattivazione rimanenti gruppi attivati ​​ai talloni aggiungendo cisteina magazzino ad una concentrazione finale di 50 mM e incubare la sospensione per 30 min a 25 ° C su una ruota girevole. Pellet le perline per centrifugazione (2 min, 16.000 xg in una microcentrifuga). Conservare il surnatante per determinare la concentrazione di proteine ​​e calcolare il rendimento di accoppiamento (vedi capitolo 2). Lavare il pellet tallone due volte con 1 ml di PBS e risospendere in 1 ml di PBS fresco a dare il prodotto finale. Nota: Il protocollo sopra tipicamente darà 1 ml di proteine ​​accoppiato, ad una concentrazione finale di proteine ​​5 mM, che può essere utilizzato come uno stock 10x per esperimenti successivi (vedere paragrafo 3). Per passare alla sezione 3 del protocollo, il lavoro con 100 ml / ml di tallone stock, o ad una concentrazione finale di proteine ​​500 nm. Nota: Un buon punto di partenza per questo immissioe sarà 2 × 10 12 perline / ml, determinando un accoppiamento densità media di 3 × 10 -4 proteine ​​/ Nm 2 o una distanza media di 57 nm su un cordone di diametro di 2 mm. Accoppiatore direzionale tiolo-carbossi Nota: Questo protocollo è adatto per l'accoppiamento cisteina contenente proteine ​​di sferette di polistirene carbossi-funzionalizzato. La porzione carbossile viene prima attivato utilizzando 1-etil-3- (3-dimetilamminopropil) carbodiimmide (EDC) / N-idrossisuccinimmide (NHS), Amine modificato e poi interconnessi Sulfo-SMPB (Figura 2). Figura 2. reticolazione strategia utilizzata per l'accoppiamento direzionale tiolo-carbossilico di proteine ​​di perle di polimero. Perle di polistirene carbossilati vengono prima attivati ​​con EDC e modificati con NHS per formare un semi-stabile NHS-estere. Successivamente ammina-accoppiamento ethylenedirisultati ammina in un gruppo amminico libero, che reagisce con Sulfo-SMPB. Maleimmide attivato perline possono poi reagire con cisteine ​​libere per direzionalmente paio di proteine ​​per perline. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Preparazione dei reagenti: Preparare PBS (100 mM sodio fosfato, NaCl 150 mM, pH 7,0) e autoclave. Preparare uno stock 100x (0,5 M o 287 mg / ml in PBS,) di TCEP immediatamente prima dell'uso. Preparare uno stock 10x (20 mM, o 4 mg / ml in PBS) di EDC (1-etil-3- (3-dimetilamminopropil) carbodiimmide) immediatamente prima dell'uso. Preparare uno stock 10x (50 mM, o 6 mg / ml in PBS) di NHS (N-idrossisuccinimmide) immediatamente prima dell'uso. Preparare uno stock 5x (10 mM o 4.58 mg / ml in dH 2 O) di solfo-SMPB immediatamente prima dell'uso. Preparare uno stock 10x (500 mm o 88 mg / ml in PBS, pH 7,0) di cisteina immediatamente buso rima. Attivazione Bead: Mescolare sospensione di sferette capovolgendo delicatamente e trasferire la quantità necessaria di sferette (ad esempio, 12 ml) in una provetta sterile da 1.5 ml contenente 1 ml di PBS sterile, pH 7,0. Pipettare delicatamente su e giù per lavare le perline e pellet per centrifugazione in una microcentrifuga (2 min a 16.000 xg). Rimuovere con attenzione il surnatante con una pipetta e scartare. Risospendere il pellet tallone in 1 ml di PBS sterile fresca e ripetere la fase di lavaggio. Risospendere il pellet tallone in 0,8 ml di PBS. Aggiungere 100 ml di 10x EDC magazzino (2 mm di concentrazione finale) e immediatamente 100 ml di soluzione madre 10x NHS (5 mm concentrazione finale) per la sospensione di sferette. Incubare la sospensione di sferette per 30 minuti a 25 ° C su una ruota girevole. Lavare perline una volta in 1 ml di PBS e risospendere in 0,8 ml fresca sterile PBS. Aggiungere 200 ml di etilendiammina, e incUbate sferette per 1 ora a 25 ° C su una ruota girevole. Lavare perline una volta con 1 ml di PBS e risospendere le sfere in 0,8 ml di PBS fresco. Passare dalla sezione 1.1.2.4 (attivazione tallone con Sulfo-SMPB), come descritto nella sezione 1.1.2 e seguire il resto del protocollo descritto nella sezione 1.1 (accoppiatore direzionale Thiol-ammina). Eseguire preparazione proteine ​​e gradini accoppiamento proteina in modo identico a quelli descritti nella sezione 1.1. Nota: L'efficienza di accoppiamento tipico usando questo protocollo è leggermente inferiore rispetto al punto 1.1, quindi regolare la concentrazione iniziale di proteine ​​di conseguenza per ottenere la stessa densità di accoppiamento (circa 75%.). 2. Determinazione del Coupling efficienza Nota: per determinare la concentrazione di proteine, utilizzare Bradford reagente 10 e test colorimetrici come segue: Capovolgere delicatamente Bradford reagente all'e Nsure omogeneità del reagente. Utilizzando un / ml soluzione madre BSA 10 mg, preparare standard che coprono proteine ​​concentrazioni da 0,1 a 1,5 mg / ml BSA in tampone. Aggiungere 250 ml di Bradford reagente pozzetti di una piastra a 96 pozzetti. Preparare abbastanza pozzi per tutti i campioni, gli standard di proteine ​​e controlli negativi (tampone solo). Aggiungere 5 ml di campione di proteine ​​(standard di proteine ​​o di tampone, per il controllo negativo) al reagente nella piastra a 96 pozzetti. Incubare la piastra su un agitatore orbitale a temperatura ambiente per 10 min. Misurare l'assorbanza a 595 nm usando un lettore di piastre. Generare una curva standard di concentrazione BSA contro A595 nm e utilizzare questo per determinare le concentrazioni di proteine ​​nei campioni iniziali e surnatante. Calcolare la concentrazione di proteine ​​accoppiati come segue: Calcolare l'efficienza di accoppiamento come: 00eq4.jpg "/> 3. Uso di Bead-accoppiato adesine in Assays Concorso Preparazione: Seed 1 ml per pozzetto di cellule HeLa alla concentrazione di 150.000 cellule / ml in una piastra da 24 pozzetti il ​​giorno prima del dosaggio concorso, per permettere alle cellule di raggiungere circa il 80% di confluenza prima di iniziare l'esperimento. Impostare ogni condizione sperimentale in triplice copia. Includere pozzi per i controlli negativi (nessun batteri aggiunti durante i test della concorrenza), controlli positivi (sfere di controllo accoppiati alla fusione-tag aggiunti solo durante i test della concorrenza) ei controlli di lisi (per esperimenti di citotossicità). Seminare un LB (MLB) cultura 5 ml marino con una nuova colonia di V. parahaemolyticus e crescere O / N a 30 ° C, agitando. Preparare sufficiente MAM tallone accoppiati, come descritto nella sezione 1. (Coupling). Lasciare per 100 ml di 10x tallone stock per pozzetto. Analisi della concorrenza: Il giorno della competitiesperimento ione, misurare il diametro esterno 600 della coltura batterica. Preparare supporti infezione diluendo colture batteriche in DMEM incolore senza additivi, pre-riscaldato a 37 ° C, contenente il 10% di sospensione v / v tallone (sia adesina-coupled perle o sfere di controllo), per dare una MOI di 10. Preparare 1 ml / bene e 10-20% di volume in eccesso per campione. Nota: Per le condizioni di cui sopra (24-pozzetti, V. parahaemolyticus, MOI 10), il volume necessario di O / N cultura da aggiungere ad ogni bene (ml / ml) viene calcolato come 3 / OD 600 della cultura. Ad esempio, 1 ml di mezzo infezione in genere contengono 100 ml di sospensione tallone, a pochi ml di coltura batterica e essere effettuate fino a 1 ml con incolori, DMEM senza supplementi. Rimuovere vecchio medio dai pozzetti e lavare cellule HeLa in coltura con l'aggiunta di 1 ml di PBS sterile pre-riscaldato a 37 ° C in ciascun pozzetto. Rimuovere PBS e aggiungere 1 ml di terreno infezione per bene. Anche impostare i controlli, con l'aggiunta di soluzioni di containing perline di controllo e batteri (controllo positivo) o perline adesina e nessun batteri (controlli negativi) o DMEM contenente 0,1% Triton X-100 (controllo, necessaria solo per misure di citotossicità lisi). Incubare la piastra in un incubatore di coltura tissutale a 37 ° C per il tempo desiderato (ad esempio 4 ore per misure di citotossicità o 1 ora per misurazioni di adesione). Nota: sia l'adesione batterica e la citotossicità sulle cellule ospiti possono essere utilizzati come-out di lettura per l'efficacia di inibizione. Se i punti di tempo di citotossicità e di adesione misure coincidono, entrambi i test possono essere eseguite su campioni dallo stesso pozzo, dal momento che la citotossicità è determinato utilizzando le cultura surnatante e attaccamento saggi utilizzano campioni derivati ​​dallo strato di cellule rimanenti. Misure di citotossicità: A intervalli di tempo indicati (ad esempio, 4 ore dopo l'infezione), rimuovere tre volte da 200 ml ogni 24 pozzetti e trasferimentouna piastra a 96 pozzetti. Spin piastre a 96 pozzetti a 1.500 xg, 5 min e trasferire 100 ml di ciascun pozzetto in una piastra da 96 pozzetti fresco. Aggiungere 100 ml di supporti utilizzati durante esperimenti di infezione nei pozzetti freschi della piastra a 96 pozzetti in triplice copia (questi saranno utilizzati come spazi). Eseguire il saggio deidrogenasi (LDH) rilascio di lattato utilizzando un kit di rilevamento LDH citotossicità e seguendo le istruzioni del produttore. Brevemente, calcolare la quantità di reagente necessario in incrementi di 25 (ad esempio, se 62 campioni da misurare, costituiscono miscela reagente sufficiente per 75 etc.). Ad esempio, per 100 campioni, miscelare 11,25 ml di reagente A con 250 microlitri di reagente B. Invertito, non fare vortex per evitare la formazione di schiuma. Mettere il composto in un serbatoio per poter pipettare con una pipetta multicanale. Aggiungere 100 pl di miscela reagente ogni campione. Incubare la piastra a temperatura ambiente e leggere l'assorbanza a 490 nm su un lettore di piastre a 10, 20, 30 min. </li> Analizzare il set di dati per il quale l'assorbanza del campione di controllo lisi è alto, ma ancora all'interno della gamma lineare del lettore di piastre (tipicamente, 2-3 unità di assorbanza). Esprimere i risultati come% citotossicità, con la seguente formula di conversione: Misura di adesione batterica: A intervalli di tempo indicati (ad esempio, 1 ora dopo l'infezione), rimuovere i supporti dallo strato di cellule. Lavare accuratamente lo strato di cellule con sterili, pre-riscaldato PBS (almeno 3-4 lavaggi di 1 ml di PBS ciascuno) per rimuovere tutte le cellule non-attaccato. Cellule ospiti Lyse aggiungendo 1 ml di una sterile 1% v / v Triton X-100 in PBS soluzione per pozzetto. Incubare la piastra a 37 ° C per 5 min. Pipettare ciascun campione su e giù parecchie volte prima di trasferire il contenuto di ogni pozzetto per separare provette da 1,5 ml. Preparare 10 diluizioni seriali dei campioniin PBS sterile (ad esempio, utilizzare 100 ml di campione e 900 ml di PBS). Piatto 100 ml di ciascun campione sulla MLB agar e diffondere con spatola cellulare. Ottimizzare cui diluizioni per placcare seconda delle ceppi batterici e punti di tempo. Nota: Per la configurazione sperimentale descritto, 10 5 o 10 6 diluizioni danno un congruo numero di CFU. Incubare le piastre a 37 ° CO / N ed enumerare i batteri dal conteggio delle colonie.