Materiais biomiméticos para caracterizar as interações bactérias hospedeiras-

1. O acoplamento químico de proteínas a polímeros Grânulos Tiol-amina acoplamento direccional Nota: Este protocolo é adequada para o acoplamento de proteínas contendo cisteína a amina funcionalizada pérolas de polímero, usando sulfosuccinimidil 4- (p -maleimidophenyl) butirato (sulfo-SMPB) como agente de reticulação (Figura 1). Figura 1. A reticulação estratégia utilizada para acoplamento direccional tiol-amina das proteínas de pérolas de polímero. Amina-esferas de poliestireno modificadas são activados com Sulfo-SMPB. A maleimida reage com cisteínas livres para direcionalmente proteínas par de pérolas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Preparação de reagentes: Prepare PBS (fosfato de sódio 100 mM, NaCl 150 mM, pH 7,0) e autoclave. </li> Prepara-se uma 100X (0,5 M ou 287 mg / ml em PBS) de TCEP (Tris (2-carboxietil) fosfina) imediatamente antes da utilização. Prepara-se uma lingua 5x (10 mM ou 4,58 mg / ml em dH2O) de Sulfo-SMPB imediatamente antes da utilização. Prepara-se uma lingua 10x (500 mM ou 88 mg / ml em PBS, pH 7,0) de cisteína imediatamente antes da utilização. Ativação Bead: Misture a suspensão de pérolas, invertendo suavemente e transferir a quantidade necessária de suspensão de esferas (por exemplo, 12 ml) para um tubo de 1,5 ml estéril contendo 1 ml de PBS estéril, pH 7,0. Pipeta suavemente para cima e para baixo para lavar as contas e pellet por centrifugação numa microcentrífuga (2 min a 16.000 xg). Remova cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta e descarte. Ressuspender o sedimento do grânulo em 1 ml de PBS estéril fresco e repetir o passo de lavagem. Ressuspender o sedimento em 0,8 ml de talão de PBS. Adicionar 200 ml de 10 mM preparada de fresco Sulfo-SMPB, para dar um final de concentração de 2 mM. Incubar a suspensão de esferas durante 1 hora a 25 ° C numa roda rotativa. Redução da proteína: Durante o período de incubação da etapa de activação, se preparar a proteína para o seguinte passo de acoplamento para que possa ser imediatamente adicionado às esferas activadas. Nota: Embora este passo de redução não é sempre necessária para GST (glutationa S-transferase) proteínas de fusão, recomenda-se a assegurar uma alta eficiência de acoplamento. Verifique a concentração de proteína, e ajustá-lo para a concentração final necessária para a reacção de acoplamento. Nota: proteína 6 mM em PBS, e um volume de 1 ml são normalmente utilizados. Adicionar da TCEP para dar uma concentração final de 5 mM. Incubar a solução durante 30 min à TA. Nota: A mistura de reacção pode ser utilizado directamente para a seguinte reacção de acoplamento. Reter uma pequena quantidade (alguns ml) da solução de proteína para determinar o pró tein concentração e cálculo da eficiência de acoplamento (ver secção 2). Proteína passo de acoplamento: Agregar as esferas activadas por centrifugação (2 minutos, 16.000 xg numa microcentrífuga), e lava-se a pelota uma vez em 1 ml de PBS estéril fresco. Ressuspender o sedimento em solução de proteína preparada (por exemplo, 1 ml), para dar a concentração de proteína desejada. Nota: A concentração de proteína durante o passo de acoplamento vai depender da eficiência média de acoplamento (ver secção 2 para a determinação da eficiência de acoplamento) e densidade de acoplamento desejado (tal como calculados em 1.1.4.3). A eficácia é de cerca de 85% e a concentração final desejada em 5 mM de 10x a suspensão do grânulo, de modo que a concentração de proteína durante o passo de acoplamento deve ser de aproximadamente 6 mm. Calcula-se a densidade de acoplamento utilizando a seguinte fórmula: jpg "/> onde ρ c densidade de acoplamento [número de moléculas de proteína / nm 2], proteína concentração de proteína conc [mg / ml], proteína M w peso molecular da proteína [Da], talão conc concentração talão [número de contas / L], diâmetro do grânulo d [nm 2] O número de Avogadro Utilizar a densidade de acoplamento para o cálculo do espaçamento médio ligando: Incubar a suspensão de proteína de grânulo durante 2 horas a 25 ° C numa roda rotativa. Nota: Algunsproteínas pode não ser estável à temperatura ambiente. Nestes casos, a reacção pode ser levada a cabo a 4 ° CO / N. Desactivar restantes grupos activados sobre os grânulos por adição de estoque de cisteína até uma concentração final de 50 mM e incuba-se a suspensão durante 30 min a 25 ° C numa roda rotativa. Sedimentar as pérolas por centrifugação (2 minutos, 16.000 xg numa microcentrífuga). Manter o sobrenadante para a determinação da concentração de proteína e o cálculo da eficiência de acoplamento (ver secção 2). Lava-se a pelete duas vezes com talão 1 ml de PBS e ressuspender em 1 ml de PBS fresco para dar o produto final. Nota: O protocolo acima irá tipicamente dar 1 ml de proteína acoplada, a uma concentração final de proteína de 5 mm, o que pode ser usado como um estoque 10x para experiências subsequentes (ver secção 3). Para prosseguir com a secção 3 do protocolo, trabalhar com 100 ml / ml de estoque de talão ou a uma concentração final de 500 nM de proteína. Nota: Um bom ponto de partida para este Procedure será de 2 × 10 12 contas / ml, resultando numa densidade média de acoplamento de 3 x 10 -4 proteínas / nm 2 ou um espaçamento médio de 57 nm sobre um grânulo de 2 mm de diâmetro. Acoplamento direccional tiol-carboxi Nota: Este protocolo é adequado para o acoplamento de cisteína contendo proteínas para esferas de poliestireno funcionalizado-carboxilo. O radical carboxilo é primeiro activado usando 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) / N-hidroxissuccinimida (NHS), e, em seguida, amina modificada reticulada usando Sulfo-SMPB (Figura 2). Figura 2. A reticulação estratégia utilizada para acoplamento direccional tiol-carboxilo de proteínas com pérolas de polímero de poliestireno carboxilado. Grânulos são primeiro activado com EDC e modificadas com NHS para formar um semi-estável de NHS-éster. Subsequente amina-acoplamento de ethylenediResultados da amina num grupo amina livre, a qual reage com Sulfo-SMPB. Maleimida ativado grânulos podem então reagir com cisteínas livres para direcionalmente proteínas par de pérolas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Preparação de reagentes: Prepare PBS (fosfato de sódio 100 mM, NaCl 150 mM, pH 7,0) e autoclave. Prepara-se uma 100X (0,5 M ou 287 mg / ml em PBS), de TCEP imediatamente antes da utilização. Prepara-se uma 10x estoque (20 mM, ou 4 mg / ml em PBS) de EDC (1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida) imediatamente antes da utilização. Prepara-se uma 10x estoque (50 mM, ou 6 mg / ml em PBS) de NHS (N-hidroxissuccinimida) imediatamente antes da utilização. Prepara-se uma lingua 5x (10 mM ou 4,58 mg / ml em dH2O) de Sulfo-SMPB imediatamente antes da utilização. Prepara-se uma lingua 10x (500 mM ou 88 mg / ml em PBS, pH 7,0) de cisteína imediatamente bntes de uso. Ativação Bead: Misture a suspensão do grânulo, invertendo suavemente e transferir a quantidade necessária de suspensão de esferas (por exemplo, 12 ml) para um tubo de 1,5 ml estéril contendo 1 ml de PBS estéril, pH 7,0. Pipeta suavemente para cima e para baixo para lavar as contas e pellet por centrifugação numa microcentrífuga (2 min a 16.000 xg). Remova cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta e descarte. Ressuspender o sedimento do grânulo em 1 ml de PBS estéril fresco e repetir o passo de lavagem. Ressuspender o sedimento em 0,8 ml de talão de PBS. Adicionar 100 ml de 10x da EDC (2 mM de concentração final) e imediatamente 100 ml de solução de reserva 10x de NHS (5 mM de concentração final) para a suspensão do grânulo. Incubar a suspensão de esferas durante 30 minutos a 25 ° C numa roda rotativa. Lavar grânulos uma vez em 1 ml de PBS e ressuspender em 0,8 ml de PBS estéril fresco. Adicione 200 ml de etilenodiamina, e incUbate da suspensão de esferas durante 1 hora a 25 ° C numa roda rotativa. Lavar grânulos uma vez com 1 ml de PBS e ressuspender as contas em 0,8 ml de PBS fresco. Proceda da secção 1.1.2.4 (ativação talão com Sulfo-SMPB) conforme descrito no ponto 1.1.2 e siga o resto do protocolo descrito na secção 1.1 (acoplamento direcional Tiol-amina). Realizar a preparação de proteínas e acoplamento de proteínas passos de um modo idêntico ao descrito na secção 1.1. Nota: A eficiência de acoplamento típico usando este protocolo é ligeiramente inferior em comparação com a secção 1.1, portanto, ajustar a concentração de proteína inicial em conformidade para atingir a mesma densidade de acoplamento (75% aprox.). 2. Determinação da eficiência de acoplamento Nota: Para determinar a concentração de proteína, utilizar Bradford Reagente 10 e ensaios colorimétricos como se segue: Inverta suavemente Reagente Bradford para e Nsure homogeneidade do reagente. Usando um ml de solução concentrada a 10 mg / BSA, preparar padrões de proteína cobrindo concentrações entre 0,1 e 1,5 mg / ml de BSA em tampão. Adicionar 250 ml de reagente de Bradford para poços de uma placa de 96 poços. Prepare poços suficientes para todas as amostras, padrões de proteínas e controles negativos (apenas tampão). Adicionar 5 ml de amostra de proteína (padrões proteicos ou tampão, para o controlo negativo) ao reagente na placa de 96 poços. Incubar a placa num agitador orbital à temperatura ambiente durante 10 min. Medir a absorvância a 595 nm utilizando um leitor de placas. Gerar uma curva padrão de concentração BSA contra A595 nm e usar isso para determinar concentrações de proteínas em amostras iniciais e sobrenadante. Calcula-se a concentração de proteína acoplada como se segue: Calcula-se a eficiência de acoplamento como: 00eq4.jpg "/> 3. Utilização de Bead-acoplado Adesinas em ensaios de competição Preparação: Semente de 1 ml por poço de células HeLa, a uma concentração de 150.000 células / ml numa placa de 24 poços um dia antes do ensaio de competição, para permitir que as células a atingir aproximadamente 80% de confluência, antes de se iniciar o experimento. Configure cada condição experimental em triplicado. Incluir poços para controlos negativos (sem bactérias adicionados durante ensaios de competição), controlos positivos (esferas de controlo acoplados a fusão-tag só acrescentou durante ensaios de competição) e controles de lise (para experiências de citotoxicidade). Inocular um LB (MLB) cultura de 5 ml marinho com uma nova colônia de V. parahaemolyticus e crescer O / N a 30 ° C, agitando. Prepare suficiente MAM-coupled talão, como descrito na seção 1. (Coupling). Permitir para 100 ml de 10x estoque talão por poço. Ensaio de competição: No dia do competitexperimento de iões, medir a DO600 da cultura bacteriana. Prepare meio de infecção por diluição de culturas bacterianas em meio DMEM incolor sem aditivos, pré-aquecido a 37 ° C, contendo 10% de suspensão v / v grânulo (ou pérolas ou grânulos de controlo acoplado a adesina), para se obter um MOI de 10. Preparar 1 mL / bem e 10-20% de excesso de volume por amostra. Nota: Para as condições acima mencionadas (placa de 24 poços, V. parahaemolyticus, MOI 10), o volume necessário de cultura D / N para ser adicionado por poço (ml / ml) é calculada como 3 / DO600 da cultura. Por exemplo, 1 ml de meio de infecção conterão tipicamente 100 ml de suspensão de esferas, com alguns ml de cultura bacteriana e ser formadas até 1 ml com incolor, DMEM sem suplementos. Remover o meio velho dos poços e lavar as células HeLa em cultura através da adição de 1 ml de PBS estéril, pré-aquecido a 37 ° C a cada poço. Remover PBS e adicionar 1 ml de meio de infecção por poço. Também configurar os controles, adicionando soluções containing esferas de controlo e bactérias (controlo positivo) ou grânulos de adesina e sem bactérias (controlos negativos), ou DMEM contendo 0,1% de Triton X-100 (controlo, só é necessária para as medições de citotoxicidade de lise). Incubar a placa numa incubadora de cultura de tecidos a 37 ° C durante o período de tempo desejado (por exemplo, 4 horas para medições de citotoxicidade ou 1 h durante as medições de adesão). Nota: A aderência bacteriana e citotoxicidade em células hospedeiras podem ser utilizadas como limite de leitura para a eficácia da inibição. Se os pontos de tempo de citotoxicidade e de adesão medições coincidem, ambos os ensaios podem ser realizados utilizando amostras a partir do mesmo poço, uma vez que a citotoxicidade é determinada usando o sobrenadante da cultura e ensaios de ligação utilizar amostras derivadas a partir da camada de células remanescente. Medições Citotoxicidade: Nos pontos de tempo indicados (por exemplo, 4 horas após a infecção), remover três vezes 200 ml de cada um de 24 poços e a transferênciauma placa de 96 poços. Rotação placas de 96 poços a 1500 xg, 5 min e de transferência de 100 ml de cada cavidade para uma nova placa de 96 poços. Adiciona-se 100 ml de meio utilizado durante as experiências de infecção para poços frescas da placa de 96 poços em triplicado (estes vão ser usados ​​como espaços em branco). Levar a cabo o ensaio de desidrogenase (LDH), libertação de lactato, utilizando um kit de detecção da LDH citotoxicidade e seguindo as instruções do fabricante. Resumidamente, calcular a quantidade de reagente necessários em incrementos de 25 (por exemplo, se 62 amostras estão a ser medido, compõem mistura reagente suficiente para 75 etc.). Por exemplo, por 100 amostras, misturar 11,25 ml de reagente A com 250 ul de reagente B. Inverter, não vortex para evitar a formação de espuma. Coloque a mistura em um reservatório para ser capaz de pipetar com uma pipeta multi-canal. Adiciona-se 100 ul de mistura reagente a cada amostra. Incubar a placa a temperatura ambiente e ler a absorvância a 490 nm num leitor de placas a 10, 20, 30 min. </li> Analisar o conjunto de dados para o qual a absorvância da amostra de controlo de lise é elevada, mas ainda dentro da gama linear do leitor de placas (geralmente, 2-3 unidades de absorvância). Expresso de resultados como% de citotoxicidade, usando a seguinte fórmula de conversão: Medição de adesão bacteriana: Em pontos de tempo indicados (por exemplo, 1 hr de infecção pós), remova a mídia da camada de células. Lave completamente a camada de células com estéril, PBS pré-aquecido (pelo menos 3-4 lavagens de 1 ml de PBS de cada) para remover quaisquer células un-ligado. As células hospedeiras de Lise por adição de 1 ml de uma solução estéril a 1% v / v de Triton X-100 em PBS por poço. Incubar a placa a 37 ° C durante 5 min. Pipetar cada amostra cima e para baixo várias vezes antes de transferir o conteúdo de cada poço para separar tubos de 1,5 ml. Preparar 10 diluições em série de amostrasem PBS estéril (por exemplo, utilizar 100 ml de amostra e 900 ml de PBS). Placa de 100 ml de cada amostra em agar MLB e espalhado utilizando um espalhador de célula. Otimizar que diluições ao prato dependendo das estirpes bacterianas e ponto de tempo. Nota: Para a montagem experimental descrita, 10 5 ou 10 6 diluições dar um número adequado de UFCs. Incubar as placas a 37 ° CO / N e enumerar as bactérias por contagem de colónias.