박테리아 - 호스트 상호 작용의 특성을 생체 모방 재료
Summary
Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors.
Abstract
Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The biochemical and functional characterization of adhesins mediating these initial bacteria-host interactions is often compromised by the presence of other bacterial factors, such as cell wall components or secreted molecules, which interfere with the analysis. This protocol describes the production and use of biomimetic materials, consisting of pure recombinant adhesins chemically coupled to commercially available, functionalized polystyrene beads, which have been used successfully to dissect the biochemical and functional interactions between individual bacterial adhesins and host cell receptors. Protocols for different coupling chemistries, allowing directional immobilization of recombinant adhesins on polymer scaffolds, and for assessment of the coupling efficiency of the resulting “bacteriomimetic” materials are also discussed. We further describe how these materials can be used as a tool to inhibit pathogen mediated cytotoxicity and discuss scope, limitations and further applications of this approach in studying bacterial – host interactions.
Introduction
Dissecting the interactions between bacterial adhesins and host surface receptors at the host-pathogen interface is an essential step towards our understanding of the underlying mechanisms driving bacterial adhesion. Ultimately, this will help us to identify strategies to interfere with these processes during infections. In conducting such studies, we often face a dilemma: Biochemical and biophysical analysis of the molecular mechanisms of adhesin binding requires their separation from other cell wall components, which may interfere with adhesion events. On the other hand, the use of recombinant soluble proteins over-simplifies the adhesion event, by disregarding protein anchoring in the bacterial cell wall and multivalency of binding achieved through bacterial surface display. Equally, from the host cell’s perspective, encountering and binding to single adhesin molecules does not always have the same impact in terms of plasma membrane organization, membrane fluidity and receptor clustering1 and this, ultimately, makes it difficult to evaluate the impact of adhesion on host cellular signaling and the outcome of bacteria-host interactions.
Recently a method was devised, whereby recombinant purified adhesins or adhesin fragments are directionally and covalently coupled to polymer particles similar in size to bacteria, thus mimicking bacterial surface display. This approach has been used on a range of different adhesins, from Gram-negative Multivalent Adhesion Molecules (MAMs)2, 3, to Gram-positive adhesins including Staphylococcus aureus fibronectin binding protein (FnBPA)4, 5 and Streptococcus pyogenes F1 6, 7. This method has allowed the dissection of adhesin fragments important for host cell binding, identification of host surface receptors and determination of their behavior on the host cell surface, while taking both binding affinity and avidity into consideration 1, 8. Additionally, this approach has been used to investigate the efficacy of immobilized adhesins and derivatives as inhibitors of host-pathogen interactions 8, 9. It has been demonstrated that surface coupled derivatives of the Vibrio parahaemolyticus Multivalent Adhesion Molecule (MAM) 7 can be used to attenuate a range of bacterial infections in vitro, including those caused by multidrug-resistant pathogens such as Acinetobacter baumannii and methicillin-resistant S. aureus (MRSA) 7, 9.
Herein, we describe different chemistries which can be used to immobilize adhesins to commercially available functionalized polystyrene particles. Due to the wide array of available surface functionalities, labels and particle sizes, these are a useful scaffold for the production of bacteriomimetic materials to investigate adhesin-host interactions. We further describe methods for the initial characterization of the coupling reaction, and for the calculation of important properties of the resulting materials. Finally, the use of bead-coupled adhesins as competitive inhibitors of in vitro bacterial infections is discussed as an example of their application, as well as the future scope and limitations of this approach.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서, 우리는 각각 아민에 결합 티올 – 함유 단백질으로 사용되거나 카복실 변성 폴리스티렌 비드 될 수있는 두 가지 프로토콜을 기술한다. 인해 절차의 용이성, 티올 – 아민 커플 링은 바람직하지만, 원하는 비드 규격 (직경, 형광 특성)에 따라, 아민 – 작용 비드의 사용이 가능하지 않을 수 있으며, 따라서 우리는 카르 복실 레이트로 변환하는 프로토콜을 포함했다 – 아민 부분에 연구원에게 발판의 선택에 최대한의 유연성을 제공합니다. 단백질, 방향성 결합을 함유하는 임의의 시스테인 모두 티올 – 아민 및 티오 카복실 결합 작업 (즉, 그 N 말단 당 단백질, 표면 디스플레이를 흉내 고정화)는 시스테인 잔기가없는 단백질을 필요로하지만, 그는 GST 융합으로 생성된다 단백질, 또는 사이트에 의해 도입 된 단일 터미널 시스테인 잔기는 돌연변이 유발 지시가 포함되어 있습니다. 여러 반응 시스테인이 포함되어있는 경우단백질 내에서,이 단백질의 기능을 방해 할 수 랜덤 고정으로 이어질 것입니다. 많은 세균 adhesins 자연스럽게 시스테인을 포함하지 않습니다. 이 기본 구조와 기능이 돌연변이에 유지되도록하기 위해 광범위한 분석을 요구하더라도 타인 들어, 이들은, 위치 지정 돌연변이 유발에 의해 제거 될 수있다. GST 융합 단백질의 경우, 비드에 결합 된 정제 된 GST-태그 적절한 음성 대조군으로서 사용될 수있다. 이들은 종종 서로 응집 또는 비특이적 세포에 접착 높은 경향을 가지고 대조군으로 비 결합 된 비드를 사용은 피해야한다. 만 EDC 사용하는 프로토콜 1.2. 단순화 된 버전은,이 경우 커플 링 방향 커플 링을 보장 할 수 없습니다, 따라서 단백질 급 아민을 통해 발생하고 그러나에, 카르 복실 기능화 고분자 비드에 결합 단백질로 사용할 수 있습니다.
환원제로서 TCEP 그러한 dithiothr 다른 시판 및 일반적으로 사용되는 환원제로 대체되지 않아야eitol (DTT) 또는 2- 머 캅토 에탄올 (BME), 그 안에 포함되는 티올은 티올 말레이 미드 커플 링 단계에서 단백질의 결합과 경쟁하는 바와 같이. PBS가 다른 버퍼로 대체 될 수 있지만, 다음과 같은 고려 사항 : 버퍼가 차 아민을 함유하지 않을 수 (그래서 트리스 – 함유 버퍼는 적합하지 않다). 매우 낮은 (<하는 10mM) 염 농도를 함유하는 완충제를 사용하면 비드 응집을 유도하고 또한 피해야한다. 단백질 순도도 중요한 요인이 절차 동안에 고려하고, 고품질의 데이터를 달성하는, 순수한 단백질을 사용하여야한다. 우리는 통상적으로 적어도 친화 정제와 겔 여과 단계를 더 포함하는 다단계로 단백질을 정제하지만, 이온 교환 크로마토 그래피 어떤 경우에는 제 3 단계로 이루어진다. SDS-PAGE에 의해 판단하여 그 결과 커플 링에 사용 된 단백질의 순도는 통상 90 % 이상이다.
그것의 일뿐만 아니라, 초기 반응 혼합물 중 두 단백질 농도를 결정하도록 권장반응이 완료된 후 전자 상등액. 이것은 명백한 비드 결합 단백질의 농도 및 이에 결합 밀도를 결정하는 것을 도울 것이다. 두 값의 결정은 또한 커플 링 효율의 계산을 허용한다. 원하는 최종 농도 및 결합 밀도를 달성하기 위해, 후속 반응에서 초기 단백질 용액을 제조 할 때 고려 될 수있다. 반응 물질 중에 사용 농도에서 염료 복합체 형성을 방해하지 않기 때문에 브래드 포드 (Bradford) 시약은 특히, 이전 및 커플 링 반응 후, 단백질 농도의 측정에 적합하다. 낮은 단백질 농도가 사용되는 경우,이 방법은 더 민감한 검출 방법으로 대체 할 필요가있다, 그러나주의는 커플 링 반응에 포함 된 물질과 호환되어야하는 사실에 지불한다. 그것은 또한 치료와 분말 시약을 새로 제조 된 시약을 사용하여 처리하는 것이 좋습니다 (예를 들어, 저장밀폐 용기 및 실리카 비드를 사용하여, 커플 링 효율에 영향을 미칠 것이다 시약의 품질 보낸 수분 드로잉 시약)을 방지한다. 커플 링 효율이 예상보다 낮은 경우, 가능한 치료는 초기 비드와 단백질 농도를 증가시키는 것을 포함한다. 높은 농도가 사용되는 경우, 결합제의 농도가 비례 적으로 증가 될 수있는 충분한 몰 과량을 보장한다. 비드 / 단백질 농도를 수정하는 것은 일반적으로 더 나은 최적화를 향해 단계보다는 반응 시간이 증가하고있다. 비드 커플 링에 대한 프로토콜이 긴이기 때문에, 우리는 일반적으로 재료의 큰 배치를 준비합니다. 현탁액의 분취 량을 액체 질소에서 스냅 동결 몇 달 동안 -20 ℃에서 저장 될 수있다. 해동 분취 액은 다시 냉동하지 않아야하고 4 ℃로 유지 1-2 일 이내에 사용해야합니다. 그러나, 이것은 처음에 작은 배치 테스트되어야로서 사용 된 단백질의 특성 및 안정성에 따라 다를 것이다.
<p clas후술하는 바와 같이 s = "jove_content는"> 비드 결합 adhesins, 많은 애플리케이션을 위해 사용될 수있다. 이 프로토콜은 일반적으로 숙주 세포에 박테리아 바인딩 및 병원체 – 매개 세포 독성 억제를 측정하기 위해 사용되는 분석을 설명했다. 분석은 일반적으로 숙주 세포 세균의 부착의 감소 중 하나를 사용하여 경쟁적으로 바다 음식물 매개 병원체 장염 비브리오와 헬라 상피 세포의 감염을 억제하는 비드 결합 MAMS의 능력을 측정하기 위해 수행되거나 판독로서 세포 독성을 감소 . 두 경우에서, 제조 및 경쟁 분석은 동일한 프로토콜을 따른다. V.의 판독에 따라 다른 균주 비브리오가 사용되고 : POR1 세포 독성 측정을 위해 사용되는 세포 독성 균주, 비 독성 균주 POR2는 박테리아 부착을 측정하는데 사용되는 반면, 세포 사멸 및 세포 분리 결합 박테리아 정량화 과정을 절충하기 때문이다.처음 COMPEtition 실험은 숙주 세포가 세균의 첨가에 앞서 비드 미리 인큐베이션했다 제 단계적 프로토콜로 설정 하였다. V. 들어 비브리오 및 사용 비드 사양 (MAM7 결합, 2㎛ 비드) 모두 비즈 박테리아 얻어진 세포 독성 변화없이 동시에 첨가 될 수있다. 즉, 본 실험 구성에서, 비드는 숙주 세포 결합에 대해 박테리아 outcompete. 사용 된 박테리아 종과 비드 형상에 따라, 별도의 두 단계로 비드 부착 및 세균 감염을 유지하기위한 좋은 이유가있을 수 있습니다. 예를 들어, 비 – 운동성 박테리아 세포를 감염시키기 위해, 플레이트는 일반적으로 감염 배지를 첨가 한 후 원심 분리 하였다. 이 전지 층에 구슬의 매우 불균일 한 분포를 초래하기 때문에, 비드를 함유하는 현탁액을 원심 분리 판은 피해야한다. 작은 입자 크기가 사용되는 경우, 비드는, 세포 표면에 정착하는 데 시간이 오래 걸릴 경우 스와fficient 시간은 감염 이전에 비드 부착 허용해야합니다. 박테리아 부착은 판독로서 사용하는 경우에는 숙주 세포에 감염이 크게 변형에 의해 손상되지 않는 경우, 시료는 박테리아의 부착을 정량화 할 수 손상 세포 용해 및 박리와 같은 시점에서 취해 져야한다.
대신 희석 도금에 의해 박테리아의 부착을 열거, 샘플은 대안 영상 (도 5)에 대해 처리 될 수있다. 이 경우, 조직 배양 세포는 오히려 직접 우물에 비해, 유리 커버 슬립 상에 파종한다. 또한, 형광 단백질을 발현하는 형광 비드와 박테리아 감염 특정 숙주 세포 마커와 함께 사용할 수있다. 예를 들어, 경쟁 실험은 흔히 숙주 세포의 액틴 세포 골격을 염색하고 형광 청색 형광 비드와 함께, 감염에 의한 형태 학적 변화를 평가하는 적색 형광 – 로다 민 팔로이 딘을 사용하여 묘화되고녹색 (GFP가 발현 또는 SYTO18 스테인드) 박테리아.
황색 포도상 구균 FnBPA 스트렙토 화농 F1 FUD 및 비브리오 파라 헤 몰리 티 커스의 MAM 포함한 비드 결합 adhesins의 범위는, 밀착성, 부착 억제와의 밀착성의 기여를 연구 생체 모방 재료로서 사용되어왔다 병원체 – 매개 세포 독성 (1), (7), (8). 지지체로서 사용되는 중합체 비드 색 (예를 들면, 청색 형광체, 적색, 청색, 녹색, 오렌지)의 넓은 범위에서 사용할 수 있기 때문에이 방법을 사용하는 장점 중 하나는, 부착 이벤트의 시각화의 용이성이다. 그러므로, 기능을 방해 할 수 직접 표지 단백질은 피할 수있다. 또한, 이렇게 용해 단백질에 비해 더 생리 학적으로 관련 형태를 반영, 커플 링 모방에게 박테리아 표면에 adhesins의 다가 디스플레이 표면.
그대로 세균이나 bacteri를 사용하여 연구에 비해알 돌연변이, 비드 접근 방법은 세균의 증식과 관련된 문제를 회피. 음으로 숙주 세포에 영향을주는 성장 배지와 영양 결핍 산성화하고, 박테리아 복제 결국 타협 – 예를 들어, 장기간 (예를 들면, O / N) 그대로 박테리아를 이용하여 숙주 세포 세균의 유착 연구는 종종 박테리아의 성장을 수반 현상에 의해 손상된 영상 품질.
최근 비드 결합 adhesins의 사용은 박테리아의 부착 하류 신호 전달 프로세스에 관련된 숙주 세포 인자의 친 화성 정제를위한 도구로서의 그의 용도를 포함하도록 확장되었다. V. 비브리오 MAM7는 숙주 세포막의 포스 폰산의 결합을 통해에서 RhoA 활성화 악틴 재구성 1,3- 트리거. MAM 결합 비즈 정화 MAM-숙주 세포의 결과로서 조립 된 시그널링 플랫폼에 관여하는 단백질을 식별하는 데 사용되는 제본. 구슬 수 있기 때문에쉽게 짧은 원심 분리 단계에 의해 상등액으로부터 분리하고, 관심의 단백질에 공유 결합되고, 이는 프로테오믹스 또는 웨스턴 같은 하류 애플리케이션에 사용될 수 관련된 단백질 복합체를 오염 단백질로부터의 분리를 달성하고 풍부하게 할 수있는 좋은 방법이다 블로 팅.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank members of the Krachler group for critical reading of the manuscript. DHS, DV and AMK were funded by the Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BB/L007916/1), FA was funded by a Republic of Iraq Ministry of Higher Education and Scientific Research Scholarship and NPS was funded by a CONICYT Scholarship.
Materials
| Reagents | |||
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Sigma | 646547 | Danger; corrosive can be bought as solution or freshly prepared |
| Sulfosuccinimidyl 4-(p-maleimidophenyl)butyrate (Sulfo-SMPB) | Fisher | PN22317 | Danger; toxic |
| L-cysteine | Sigma | 30089 | Danger; toxic |
| Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent blue – aqueous suspension, 2.0 μm mean particle size | Sigma | L0280 | harmful; a range of alternative particle sizes and colors is available |
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC) | Thermo scientific | 22980 | |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Thermo scientific | 24500 | |
| Carboxylate-modified polystyrene beads | Sigma | CLB9 | harmful; a range of alternative particle sizes and colors is available |
| Ethylenediamine | Sigma | E26266 | Danger; flammable, corrosive, toxic, sensitizing |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Promega | W3841 | |
| Bradford reagent | Sigma | B6916 | Danger; corrosive and toxic |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose – With 4500 mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine, sodium pyruvate, and phenol red, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | D1145 | for infection experiments |
| DMEM | Sigma | D6429 | for maintenance of cultured host cells |
| Fetal Bovine Serum, heat inactivated | Sigma | F9665 | supplement for tissue culture medium |
| Penicillin-Streptomycin – Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
Sigma | F9665 | supplement for tissue culture medium |
| PBS | Sigma | D8537 | |
| LDH Cytotoxicity detection kit | Takara | MK401 | |
| Plasticware | |||
| reagent reservoirs (25ml) | SLS | F267660 | |
| 24-well plates | Greiner | 662160 | |
| 96-well plates | Greiner | 655182 | |
| Equipment | |||
| haemocytometer | |||
| microcentrifuge | |||
| plate reader | |||
| tissue culture facilities | |||
| multichannel pipette |
References
- Lim, J., Stones, D. H., Hawley, C. A., Watson, C. A., Krachler, A. M. Multivalent Adhesion Molecule 7 clusters act as signaling platform for host cellular GTPase activation and facilitate epithelial barrier dysfunction. PLoS Pathog. 10 (9), e1004421 (2014).
- Krachler, A. M., Ham, H., Orth, K. Outer membrane adhesion factor multivalent adhesion molecule 7 initiates host cell binding during infection by gram-negative pathogens. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (28), 11614-11619 (2011).
- Krachler, A. M., Orth, K. Functional characterization of the interaction between bacterial adhesin multivalent adhesion molecule 7 (MAM7) protein and its host cell ligands. J Biol Chem. 286 (45), 38939-38947 (2011).
- Joh, D., Speziale, P., Gurusiddappa, S., Manor, J., Hook, M. Multiple specificities of the staphylococcal and streptococcal fibronectin-binding microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules. Eur J Biochem. 258 (2), 897-905 (1998).
- Bingham, R. J., et al. Crystal structures of fibronectin-binding sites from Staphylococcus aureus FnBPA in complex with fibronectin domains. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105 (34), 12254-12258 (2008).
- Ensenberger, M. G., et al. Specific interactions between F1 adhesin of Streptococcus pyogenes and N-terminal modules of fibronectin. J Biol Chem. 276 (38), 35606-35613 (2001).
- Hawley, C. A., Watson, C. A., Orth, K., Krachler, A. M. A MAM7 peptide-based inhibitor of Staphylococcus aureus adhesion does not interfere with in vitro host cell function. PLoS One. 8 (11), e81216 (2013).
- Krachler, A. M., Ham, H., Orth, K. Turnabout is fair play: use of the bacterial Multivalent Adhesion Molecule 7 as an antimicrobial agent. Virulence. 3 (1), 68-71 (2012).
- Krachler, A. M., Mende, K., Murray, C., Orth, K. In vitro characterization of multivalent adhesion molecule 7-based inhibition of multidrug-resistant bacteria isolated from wounded military personnel. Virulence. 3 (4), 389-399 (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
