חומרי Biomimetic לאפיין אינטראקציות חיידקים-מארח
Summary
Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors.
Abstract
Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The biochemical and functional characterization of adhesins mediating these initial bacteria-host interactions is often compromised by the presence of other bacterial factors, such as cell wall components or secreted molecules, which interfere with the analysis. This protocol describes the production and use of biomimetic materials, consisting of pure recombinant adhesins chemically coupled to commercially available, functionalized polystyrene beads, which have been used successfully to dissect the biochemical and functional interactions between individual bacterial adhesins and host cell receptors. Protocols for different coupling chemistries, allowing directional immobilization of recombinant adhesins on polymer scaffolds, and for assessment of the coupling efficiency of the resulting “bacteriomimetic” materials are also discussed. We further describe how these materials can be used as a tool to inhibit pathogen mediated cytotoxicity and discuss scope, limitations and further applications of this approach in studying bacterial – host interactions.
Introduction
Dissecting the interactions between bacterial adhesins and host surface receptors at the host-pathogen interface is an essential step towards our understanding of the underlying mechanisms driving bacterial adhesion. Ultimately, this will help us to identify strategies to interfere with these processes during infections. In conducting such studies, we often face a dilemma: Biochemical and biophysical analysis of the molecular mechanisms of adhesin binding requires their separation from other cell wall components, which may interfere with adhesion events. On the other hand, the use of recombinant soluble proteins over-simplifies the adhesion event, by disregarding protein anchoring in the bacterial cell wall and multivalency of binding achieved through bacterial surface display. Equally, from the host cell’s perspective, encountering and binding to single adhesin molecules does not always have the same impact in terms of plasma membrane organization, membrane fluidity and receptor clustering1 and this, ultimately, makes it difficult to evaluate the impact of adhesion on host cellular signaling and the outcome of bacteria-host interactions.
Recently a method was devised, whereby recombinant purified adhesins or adhesin fragments are directionally and covalently coupled to polymer particles similar in size to bacteria, thus mimicking bacterial surface display. This approach has been used on a range of different adhesins, from Gram-negative Multivalent Adhesion Molecules (MAMs)2, 3, to Gram-positive adhesins including Staphylococcus aureus fibronectin binding protein (FnBPA)4, 5 and Streptococcus pyogenes F1 6, 7. This method has allowed the dissection of adhesin fragments important for host cell binding, identification of host surface receptors and determination of their behavior on the host cell surface, while taking both binding affinity and avidity into consideration 1, 8. Additionally, this approach has been used to investigate the efficacy of immobilized adhesins and derivatives as inhibitors of host-pathogen interactions 8, 9. It has been demonstrated that surface coupled derivatives of the Vibrio parahaemolyticus Multivalent Adhesion Molecule (MAM) 7 can be used to attenuate a range of bacterial infections in vitro, including those caused by multidrug-resistant pathogens such as Acinetobacter baumannii and methicillin-resistant S. aureus (MRSA) 7, 9.
Herein, we describe different chemistries which can be used to immobilize adhesins to commercially available functionalized polystyrene particles. Due to the wide array of available surface functionalities, labels and particle sizes, these are a useful scaffold for the production of bacteriomimetic materials to investigate adhesin-host interactions. We further describe methods for the initial characterization of the coupling reaction, and for the calculation of important properties of the resulting materials. Finally, the use of bead-coupled adhesins as competitive inhibitors of in vitro bacterial infections is discussed as an example of their application, as well as the future scope and limitations of this approach.
Protocol
Representative Results
Discussion
בזאת, אנו מתארים שני פרוטוקולים, אשר יכול לשמש לחלבונים המכיל תיאול זוג amine- או חרוזי פוליסטירן-שונה carboxylate, בהתאמה. בשל הקלות של ההליך, צימוד תיאול-אמין עדיף, אך בהתאם למפרט הרצוי חרוז (קוטר, תכונות הקרינה), שימוש בחרוזים פונקציונליות אמין לא יכולים להיות אפשריים ועל כן כללנו פרוטוקול שיהיה להמיר carboxylate – למחצית אמין לתת חוקר הגמישות הגדולה ביותר האפשרית בבחירה של פיגום. למרות ששני תיאול-אמין ועבודת צימוד תיאול-carboxyl לכל ציסטאין המכיל חלבון, צימוד כיוונית (כלומר, חוסר תנועה של החלבון לכל N-הסופית שלה, מחקה תצוגת משטח) דורש חלבון ללא שאריות ציסטאין, כי הוא מיוצר כהיתוך GST חלבון, או שמכיל שאריות ציסטאין מסוף יחידה שהוצגו על ידי אתר מכוון mutagenesis. אם cysteines תגובתי מרובה כלוליםבתוך החלבון, זה יוביל לחוסר תנועה אקראית שעלולות לעכב את תפקוד חלבון. adhesins חיידקים רב אינו מכיל cysteines באופן טבעי. עבור אחרים, אלה ניתן להסיר על ידי mutagenesis אתר מכוון, אם כי זה ידרוש מבחני נרחבים כדי להבטיח מבנה ותפקוד האם נשמרים במוטציה. לחלבונים היתוך GST, GST-תג מטוהר מצמידים את חרוזים יכול לשמש כביקורת שלילית מתאימה. שימוש בחרוזי נחק כביקורת יש להימנע, כמו אלה לעתים קרובות יש נטייה גבוהה יותר לגוש ביחד או לדבוק תאים שאינם ספציפי. גרסה פשוטה יותר של פרוטוקול 1.2., באמצעות EDC בלבד, יכולה לשמש לכמה חלבונים לחרוזי פולימרים פונקציונליות carboxyl, אולם במקרה זה צימוד מתרחש באמצעות אמינים ראשוניים בחלבון ולכן אינו מבטיח צימוד כיוונית.
TCEP כסוכן צמצום לא חייב להיות מוחלף עם סוכנים אחרים זמינים מסחרית ונפוצים צמצום, כגון dithiothreitol (DTT) או 2-mercaptoethanol (BME), כthiols הכיל בתוכם יתחרה עם צימוד חלבון בשלב צימוד תיאול-maleimide. PBS עשוי להיות מוחלף עם מאגרים אחרים, אבל לשיקולים הבאים: חוצצים לא יכילו אמינים ראשוניים (כך מאגרי טריס המכילים אינם מתאימים). שימוש במאגרים המכילים ריכוזי מלח (<10 מ"מ) מאוד נמוכים מוביל לחרוז clumping ויש להימנע גם. טוהר חלבון הוא גם גורם חשוב לשקול במהלך הליך זה, וכדי להשיג נתונים באיכות גבוהה, יש להשתמש בחלבונים טהורים. אנחנו באופן שיגרתי לטהר חלבונים בשלבים מרובים, כוללים לפחות צעד טיהור זיקה וסינון ג'ל, אך במקרים מסוימים יון כרומטוגרפיה חילופי נעשה כצעד שלישי. כתוצאה מכך טוהר של חלבונים המשמשים לצימוד הוא בדרך כלל 90% ומעלה, כפי שיישפט על ידי SDS-עמוד.
מומלץ לקבוע ריכוזי חלבון הן בתערובת התגובה הראשונית, כמו גם של הsupernatant דואר לאחר השלמת תגובה. זה יעזור לקבוע את ריכוז חלבון לכאורה מצמידים חרוז של, ובכך צפיפות צימוד. נחישות של שני הערכים גם תאפשר חישוב של יעילות הצימוד. זה יכול להילקח בחשבון בעת הכנת פתרון החלבון הראשוני בתגובות הבאות, כדי להשיג את צפיפות ריכוז וצימוד הסופית הרצויה. מגיב ברדפורד מתאים במיוחד לקביעת ריכוז חלבון לפני ואחרי תגובת הצימוד, כמו שאף אחד מהחומרים בתגובה מפריעה להיווצרות המורכבת הצבע בריכוזים בשימוש. אם ריכוזי חלבון נמוכים יותר לשימוש, שיטה זו עשויה להיות מוחלפת על ידי שיטת זיהוי רגישה יותר, עם זאת תשומת לב צריכה להיות משולמת לעובדה שזה צריך להיות תואם עם החומרים הכלולים בתוך תגובת הצימוד. כמו כן, מומלץ להשתמש בחומרים כימיים מוכנים טרי ולהתמודד עם ריאגנטים אבקה בזהירות (למשל, חנות במכל אטום ולהשתמש חרוזים סיליקה, כדי למנוע את ריאגנטים ציור לחות) מאז האיכות של חומרים כימיים ישפיע על יעילות הצימוד. אם את יעילות הצימוד היא נמוכה מהצפוי, פתרונות אפשריים כוללים הגדלת ריכוזי חרוז וחלבון הראשוני. אם ריכוזים גבוהים יותר נמצאים בשימוש, הריכוז של חומרים כימיים צימוד יש להגדיל באופן יחסי על מנת להבטיח עודף טוחנת מספיק. שינוי ריכוזי חרוז / חלבון הוא בדרך כלל צעד טוב יותר לקראת אופטימיזציה במקום להגדיל את זמני תגובה. מאז הפרוטוקולים לצימוד חרוז הם ארוכים, אנחנו בדרך כלל להכין אצווה גדולים של חומר. Aliquots של ההשעיה ניתן snap-קפוא בחנקן נוזלי ומאוחסן ב -20 ° C למשך מספר חודשים. לא צריך להיות refrozen aliquots המופשר וצריך להיות כל הזמן על 4 מעלות צלזיוס ומשמש בתוך 1-2 ימים. עם זאת, זה ישתנה עם הטבע והיציבות של החלבון המשמש כצריך להיבדק על אצווה קטן בתחילה.
<p class = "jove_content"> adhesins מצמיד יד יכול לשמש ליישומים רבים, כמפורט להלן. פרוטוקול זה מתואר assay שמשמש בדרך כלל למדידת עיכוב של cytotoxicity המחייב ותיווך פתוגן חיידקים על תאי מארח. Assay מבוצע בדרך כלל כדי למדוד את היכולת של MAMs מצמידים חרוז לעכב תחרותי זיהום של תאי האפיתל הלה עם parahaemolyticus Vibrio הפתוגן נשא פרותי הים, או באמצעות ירידה בקובץ מצורף חיידקים לארח תאים או מופחת רעיל כמו קריאה מתוך . בשני המקרים, מבחני הכנה ומעקב תחרות באותו הפרוטוקול. בהתאם את ההודעה, זנים שונים של V. parahaemolyticus נמצא בשימוש: המתח ציטוטוקסיות POR1 משמש למדידות רעילות, ואילו המתח שאינו רעיל לתאי POR2 משמש למדידת הידבקות חיידקים, מאז המוות של תאים וניתוק תא פוגעים בהליך לכימות חיידקים מצורפים.בתחילה, compeניסויי tition הוקמו כפרוטוקול צעד חכם, שבו תאי מארח היו הראשונים מראש מודגרות-עם חרוזים לפני התוספת של חיידקים. לV. parahaemolyticus ומפרטי חרוז משמשים (2 מיקרומטר חרוזים מצמידים MAM7), ניתן להוסיף שני חרוזים וחיידקים באותו הזמן ללא שינויים ברעילים וכתוצאה מכך. כלומר, בהגדרת ניסוי זה, חרוזים לגבור חיידקים לתא מארח מחייב. בהתאם לגאומטרית המינים וחרוז חיידקים משמשת, ייתכנו סיבות טובות לשמירה על הידבקות חרוז וזיהום חיידקים כשני שלבים נפרדים. לדוגמה, כדי להדביק תאים עם חיידקים שאינם ניע, צלחות centrifuged נפוצות לאחר תוספת של תקשורת הזיהום. עם זאת, יש להימנע צנטריפוגה של צלחות המכילות השעיות חרוז, שכן זה מוביל לחלוקה לא שווה ביותר של חרוזים על שכבת התאים. אם גודל חלקיקים קטן יותר נמצא בשימוש, חרוזים ייקחו יותר זמן להתיישב על פני התא, במקרה שsuזמן fficient יש לאפשר לקובץ מצורף חרוז לפני הזיהום. כאשר הידבקות חיידקים משמשת כהקריא, יש לקחת דגימות בנקודות זמן שבו תאי מארח לא נפגעו באופן משמעותי על ידי מתח ההדבקה, כמו ניתוק תא ותמוגה יכולה להתפשר כימות של חיידקים מצורפים.
במקום ספירת הידבקות חיידקים על ידי ציפוי דילול, דגימות יכולות לחלופין להיות מעובד להדמיה (איור 5). במקרה זה, צריכים להיות נזרעו תאים בתרבית רקמה על תלושי כיסוי זכוכית, ולא ישירות לתוך בארות. בנוסף, ניתן להשתמש בחרוזי ניאון וחיידקים להביע חלבון פלואורסצנטי, יחד עם סמני תא מארח זיהום ספציפי. לדוגמא, ניסויי תחרות בדרך הדמיה באמצעות rhodamine-phalloidin האדום ניאון להכתים cytoskeleton אקטין תאי המארח ולהעריך שינויים מורפולוגיים הנובעים מזיהום, יחד עם חרוזים כחולים ניאון וניאוןירוק (GFP להביע או SYTO18 מוכתם) חיידקים.
מגוון של adhesins מצמידים חרוז, כוללים Staphylococcus aureus FnBPA, Streptococcus pyogenes F1 FUD וMAM parahaemolyticus Vibrio, היה בשימוש כחומרי biomimetic ללמוד הידבקות, עיכוב הידבקות והתרומה של הידבקות לתיווך פתוגן רעיל 1, 7, 8. אחד היתרונות של שימוש בגישה זו היא הקלות של הדמיה של אירועי קובץ מצורף, מאז חרוזים פולימרים המשמשים כפיגומים זמינים במגוון רחב של צבעים (למשל, אדום כחול, ניאון, כחול, כתום, ירוק). לפיכך, תיוג חלבון ישיר, שעלול להפריע לתפקוד, ניתן להימנע. בנוסף, המשטח מחקה צימוד תצוגת multivalent של adhesins על פני השטח החיידקים, ובכך משקף יותר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית קונפורמציה בהשוואה לחלבונים מסיסים.
בהשוואה למחקרים שהשתמש בחיידקים או bacteri שלמיםמוטציות אל, גישת חרוז עוקפת בעיות הקשורות להתפתחות חיידקים. לדוגמא, לטווח ארוך יותר (לדוגמא, O / N) מחקרים של הידבקות חיידקים לארח תאים באמצעות חיידקים שלמים לעתים קרובות נפגעו על ידי תופעות נלוות התפתחות חיידקים – החמצה של דלדול מדיום גידול והמזין להשפיע לרעה על תאי מארח, ושכפול חיידקי סופו של דבר פוגע ב איכות הדמיה.
לאחרונה, השימוש בadhesins מצמידים חרוז הורחב לכלול את השימוש בם ככלים לpurifications זיקה של גורמי מארח סלולארי המעורבים בתהליכי איתות במורד הזרם של קובץ מצורף חיידקים. V. parahaemolyticus MAM7, באמצעות קשירה לחומצות phosphatidic בקרום התא המארח, מפעיל הפעלת RhoA וארגון מחדש יקטין 1, 3. חרוזים בשילוב MAM נמצאים בשימוש כדי לטהר ולזהות חלבונים מעורבים בפלטפורמות האיתות התאספו כתוצאה מתא MAM-מארח כְּרִיכָה. מאז חרוזים יכוליםבקלות להיות מופרד מsupernatant על ידי צעד צנטריפוגה קצר, והחלבון של עניין הוא בשילוב קוולנטית, זה הוא שיטה טובה להשגת הפרדה מחלבונים מזהמים ולהעשיר קומפלקסי חלבונים רלוונטיים, אשר יכול לשמש ליישומים במורד כגון פרוטאומיקה או מערבי סופג.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank members of the Krachler group for critical reading of the manuscript. DHS, DV and AMK were funded by the Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BB/L007916/1), FA was funded by a Republic of Iraq Ministry of Higher Education and Scientific Research Scholarship and NPS was funded by a CONICYT Scholarship.
Materials
| Reagents | |||
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Sigma | 646547 | Danger; corrosive can be bought as solution or freshly prepared |
| Sulfosuccinimidyl 4-(p-maleimidophenyl)butyrate (Sulfo-SMPB) | Fisher | PN22317 | Danger; toxic |
| L-cysteine | Sigma | 30089 | Danger; toxic |
| Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent blue – aqueous suspension, 2.0 μm mean particle size | Sigma | L0280 | harmful; a range of alternative particle sizes and colors is available |
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC) | Thermo scientific | 22980 | |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Thermo scientific | 24500 | |
| Carboxylate-modified polystyrene beads | Sigma | CLB9 | harmful; a range of alternative particle sizes and colors is available |
| Ethylenediamine | Sigma | E26266 | Danger; flammable, corrosive, toxic, sensitizing |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Promega | W3841 | |
| Bradford reagent | Sigma | B6916 | Danger; corrosive and toxic |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose – With 4500 mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine, sodium pyruvate, and phenol red, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | D1145 | for infection experiments |
| DMEM | Sigma | D6429 | for maintenance of cultured host cells |
| Fetal Bovine Serum, heat inactivated | Sigma | F9665 | supplement for tissue culture medium |
| Penicillin-Streptomycin – Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
Sigma | F9665 | supplement for tissue culture medium |
| PBS | Sigma | D8537 | |
| LDH Cytotoxicity detection kit | Takara | MK401 | |
| Plasticware | |||
| reagent reservoirs (25ml) | SLS | F267660 | |
| 24-well plates | Greiner | 662160 | |
| 96-well plates | Greiner | 655182 | |
| Equipment | |||
| haemocytometer | |||
| microcentrifuge | |||
| plate reader | |||
| tissue culture facilities | |||
| multichannel pipette |
References
- Lim, J., Stones, D. H., Hawley, C. A., Watson, C. A., Krachler, A. M. Multivalent Adhesion Molecule 7 clusters act as signaling platform for host cellular GTPase activation and facilitate epithelial barrier dysfunction. PLoS Pathog. 10 (9), e1004421 (2014).
- Krachler, A. M., Ham, H., Orth, K. Outer membrane adhesion factor multivalent adhesion molecule 7 initiates host cell binding during infection by gram-negative pathogens. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (28), 11614-11619 (2011).
- Krachler, A. M., Orth, K. Functional characterization of the interaction between bacterial adhesin multivalent adhesion molecule 7 (MAM7) protein and its host cell ligands. J Biol Chem. 286 (45), 38939-38947 (2011).
- Joh, D., Speziale, P., Gurusiddappa, S., Manor, J., Hook, M. Multiple specificities of the staphylococcal and streptococcal fibronectin-binding microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules. Eur J Biochem. 258 (2), 897-905 (1998).
- Bingham, R. J., et al. Crystal structures of fibronectin-binding sites from Staphylococcus aureus FnBPA in complex with fibronectin domains. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105 (34), 12254-12258 (2008).
- Ensenberger, M. G., et al. Specific interactions between F1 adhesin of Streptococcus pyogenes and N-terminal modules of fibronectin. J Biol Chem. 276 (38), 35606-35613 (2001).
- Hawley, C. A., Watson, C. A., Orth, K., Krachler, A. M. A MAM7 peptide-based inhibitor of Staphylococcus aureus adhesion does not interfere with in vitro host cell function. PLoS One. 8 (11), e81216 (2013).
- Krachler, A. M., Ham, H., Orth, K. Turnabout is fair play: use of the bacterial Multivalent Adhesion Molecule 7 as an antimicrobial agent. Virulence. 3 (1), 68-71 (2012).
- Krachler, A. M., Mende, K., Murray, C., Orth, K. In vitro characterization of multivalent adhesion molecule 7-based inhibition of multidrug-resistant bacteria isolated from wounded military personnel. Virulence. 3 (4), 389-399 (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
