Biomimetische materialen Bacteria-gastheer interacties karakteriseren

1. Chemische koppeling van eiwitten aan polymeerpareltjes Thiol-amine richtkoppel Opmerking: Dit protocol is geschikt voor het koppelen van cysteine-bevattende eiwitten om amine-gefunctionaliseerde polymeerkralen met behulp sulfosuccinimidyl 4- (p -maleimidophenyl) butyraat (sulfo-SMPB) als verknopingsmiddel (figuur 1). Figuur 1. Verknoping strategie voor directionele thiol-amine koppeling van eiwitten aan polymeerpareltjes. Amine-gemodificeerd polystyreen korrels worden geactiveerd met Sulfo-SMPB. De maleïmide reageert met vrije cysteines te koppelen eiwitten directioneel aan kralen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Bereiding van reagentia: Bereid PBS (100 mM natriumfosfaat, 150 mM NaCl, pH 7,0) en autoclaaf. </li> Bereid een 100x stock (0,5 M of 287 mg / ml in PBS) van TCEP (tris (2-carboxyethyl) fosfine) onmiddellijk voor gebruik. Bereid een 5x voorraad (10 mM en 4,58 mg / ml in dH 2 O) van Sulfo-SMPB onmiddellijk voor gebruik. Bereid een 10x voorraad (500 mM of 88 mg / ml in PBS, pH 7,0) van cysteïne onmiddellijk voor gebruik. Kraal activering: Meng de parelsuspensie door voorzichtig omkeren en breng de vereiste hoeveelheid kralensuspensie (bijvoorbeeld 12 ml) in een steriele 1,5 ml buis die 1 ml steriel PBS, pH 7,0. Voorzichtig pipet op en neer naar de kralen en pellet wassen door centrifugeren in een microcentrifuge (2 min bij 16.000 xg). Verwijder de bovenstaande vloeistof met een pipet en gooi zorgvuldig. Resuspendeer de pellet in bead 1 ml verse steriele PBS en herhaal de wasstap. Resuspendeer de pellet in 0,8 kraal ml PBS. Voeg 200 ml vers bereide 10 mM sulfo-SMPB tot een uiteindelijke concent gevenrantsoen van 2 mM. Incubeer de kraal suspensie 1 uur bij 25 ° C op een roterend wiel. Eiwit reductie: Tijdens de incubatietijd van de activeringsstap, bereidt het eiwit de volgende koppelingsstap zodat deze direct kan worden toegevoegd aan de geactiveerde korrels. Noot: Hoewel reductiestap is niet altijd vereist voor GST (glutathion S-transferase) fusie-eiwitten, is het raadzaam om een ​​hoog koppeling efficiëntie. Controleer de eiwitconcentratie, en aanpassen aan de uiteindelijke concentratie die nodig is voor de koppelingsreactie. Opmerking: 6 mM eiwit in PBS en een volume van 1 ml worden gewoonlijk gebruikt. Voeg TCEP voorraad tot een uiteindelijke concentratie van 5 mM. Incubeer de oplossing gedurende 30 min bij kamertemperatuur. Opmerking: Het reactiemengsel kan direct worden gebruikt voor de volgende koppelingsreactie. Bewaar een kleine hoeveelheid (enkele ml) van de eiwitoplossing te bepalen welke pro eiwit concentratie en de berekening van de koppeling efficiëntie (zie punt 2). Eiwit koppelingsstap: Pellet de geactiveerde kralen door centrifugering (2 min, 16.000 xg in een microcentrifuge) en was de pellet één keer in 1 ml verse steriele PBS. Resuspendeer de pellet in de bereide eiwitoplossing (bijvoorbeeld 1 ml) om de gewenste eiwitconcentratie geven. Opmerking: De proteïneconcentratie tijdens de koppelingsstap is afhankelijk van de gemiddelde koppelrendement (zie hoofdstuk 2 voor bepaling van de koppelingsefficiëntie) en de gewenste koppeling dichtheid (zoals berekend 1.1.4.3). Het rendement is ongeveer 85% en de gewenste eindconcentratie 5 mM in 10x kralensuspensie, zodat proteïneconcentratie tijdens de koppelingsstap moet ongeveer 6 mM. Bereken de dichtheid koppeling met de volgende formule: jpg "/> waarbij ρ c koppeling dichtheid [aantal eiwitmoleculen / nm 2], eiwit conc proteïneconcentratie [mg / ml], eiwit Mw eiwit moleculair gewicht [Da] kraal conc kraal concentratie [aantal kralen / L] d kraal diameter [nm 2] Getal van Avogadro Met de koppeling dichtheid gemiddelde ligand afstand te berekenen: Incubeer de eiwit-bead suspensie 2 uur bij 25 ° C op een roterend wiel. Opmerking: Sommigeeiwitten niet stabiel bij kamertemperatuur. In deze gevallen kan de reactie worden uitgevoerd bij 4 ° CO / N uitgevoerd. Deactiveren resterende geactiveerde groepen op de parels door het toevoegen van cysteine ​​voorraad tot een uiteindelijke concentratie van 50 mM en incubeer de suspensie gedurende 30 min bij 25 ° C op een roterend wiel. Pellet de kralen door centrifugering (2 min, 16.000 xg in een microcentrifuge). Houd de bovenstaande vloeistof voor de bepaling van de eiwitconcentratie en de berekening van de koppeling efficiëntie (zie punt 2). Was de kraal pellet tweemaal met 1 ml PBS en resuspendeer in 1 ml verse PBS aan het eindproduct. Opmerking: De bovenstaande protocol kenmerkend geeft 1 ml proteïne gekoppelde, bij een eindconcentratie van 5 mM eiwit, dat kan worden gebruikt als een 10x voorraad voor volgende experimenten (zie sectie 3). Om door te gaan naar deel 3 van het protocol, met 100 ml / ml van de kraal voorraad, of bij een uiteindelijke concentratie van 500 nM eiwit. Opmerking: Een goed uitgangspunt voor deze procedure wordt 2 x 10 12 parels / ml, resulterend in een gemiddelde koppeling dichtheid van 3 x 10 -4 proteïnen / 2 nm of een gemiddelde afstand van 57 nm op een kraal van 2 mm diameter. Thiol-carboxy richtkoppel Opmerking: Dit protocol is geschikt voor het koppelen van cysteine-bevattende eiwitten te carboxyl gefunctionaliseerd polystyreen korrels. De carboxylgroep wordt eerst geactiveerd met 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) / N-hydroxysuccinimide (NHS), amine gemodificeerd en vervolgens verknoopt via sulfo-SMPB (figuur 2). Figuur 2. Cross-linking strategie voor directionele thiol-carboxyl koppeling van eiwitten aan polymeerpareltjes. Gecarboxyleerde polystyreen korrels worden eerst geactiveerd met EDC en NHS gemodificeerd met een semi-stabiele NHS-ester. Daaropvolgende amine-koppeling van ethylenediamine resulteert in een vrije aminegroep, die reageert met Sulfo-SMPB. Maleïmide geactiveerde kralen kan vervolgens reageren met vrije cysteines te koppelen eiwitten directioneel aan kralen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Bereiding van reagentia: Bereid PBS (100 mM natriumfosfaat, 150 mM NaCl, pH 7,0) en autoclaaf. Bereid een 100x stock (0,5 M of 287 mg / ml in PBS) van TCEP onmiddellijk voor gebruik. Bereid een 10x voorraad (20 mM, of 4 mg / ml in PBS) EDC (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide) onmiddellijk voor gebruik. Bereid een 10x voorraad (50 mM, of 6 mg / ml in PBS) NHS (N-hydroxysuccinimide) onmiddellijk voor gebruik. Bereid een 5x voorraad (10 mM en 4,58 mg / ml in dH 2 O) van Sulfo-SMPB onmiddellijk voor gebruik. Bereid een 10x voorraad (500 mM of 88 mg / ml in PBS, pH 7,0) van cysteïne onmiddellijk before gebruik. Kraal activering: Meng kralensuspensie door voorzichtig omkeren en breng de vereiste hoeveelheid kralensuspensie (bijvoorbeeld 12 ml) in een steriele 1,5 ml buis die 1 ml steriel PBS, pH 7,0. Voorzichtig pipet op en neer naar de kralen en pellet wassen door centrifugeren in een microcentrifuge (2 min bij 16.000 xg). Verwijder de bovenstaande vloeistof met een pipet en gooi zorgvuldig. Resuspendeer de pellet in bead 1 ml verse steriele PBS en herhaal de wasstap. Resuspendeer de pellet in 0,8 kraal ml PBS. Voeg 100 ml van 10x EDC voorraad (2 mM uiteindelijke concentratie) en onmiddellijk 100 ml 10x NHS voorraad-oplossing (5 mM uiteindelijke concentratie) naar de kraal schorsing. Incubeer de parelsuspensie gedurende 30 min bij 25 ° C op een roterend wiel. Was korrels eenmaal in 1 ml PBS en resuspendeer in 0,8 ml vers steriel PBS. Voeg 200 ml ethyleendiamine, en meerderUbate de kraal suspensie 1 uur bij 25 ° C op een roterend wiel. Was parels eenmaal met 1 ml PBS en resuspendeer de kralen in 0,8 ml vers PBS. Gaan van punt 1.1.2.4 (kraal activering met Sulfo-SMPB) zoals beschreven in paragraaf 1.1.2 en volg de rest van de in paragraaf 1.1 (thiol-amine-directionele koppeling) beschreven protocol. Voeren eiwit voorbereiding en eiwitkoppeling stappen op een wijze identiek aan die in paragraaf 1.1 beschreven. Opmerking: De typische koppelrendement met dit protocol iets lager in vergelijking met sectie 1.1, dus de aanvankelijke eiwitconcentratie te passen om dezelfde koppeling dichtheid te bereiken (circa 75%.). 2. Bepaling van koppelingsefficiëntie Opmerking: Om eiwitconcentratie te bepalen, gebruiken Bradford reagens 10 en colorimetrische assays als volgt: Voorzichtig omkeren Bradford reagens naar e NSure homogeniteit van het reagens. Met behulp van een 10 mg / ml BSA voorraadoplossing bereiden eiwitstandaarden die concentraties van 0,1 tot 1,5 mg / ml BSA in buffer. Voeg 250 ml van Bradford reagens aan putjes van een 96-wells plaat. Bereid genoeg putten voor alle monsters, eiwit standaarden en negatieve controles (alleen buffer). Voeg 5 ml eiwitmonster (eiwitstandaarden of buffer, de negatieve controle) aan het reagens in de 96-well plaat. Incubeer de plaat op een orbitale schudder bij kamertemperatuur gedurende 10 min. Meet de absorptie bij 595 nm met behulp van een plaat lezer. Genereren van een standaard curve van BSA concentratie versus A595 nm en dit gebruiken om eiwit-concentraties bepalen in de initiële en supernatant monsters. Bereken de concentratie van proteïne gekoppelde als volgt: Bereken de koppeling efficiëntie: 00eq4.jpg "/> 3. Gebruik van Bead-gekoppelde adhesinen in competitietesten Voorbereiding: Seed 1 ml per putje van Hela cellen bij een concentratie van 150.000 cellen / ml in een 24-wells plaat de dag voor de competitieve test, zodat de cellen ongeveer 80% confluentie bereiken vóór het begin van het experiment. Het opzetten van elke experimentele conditie in drievoud. Onder meer putten voor negatieve controles (geen bacteriën toegevoegd tijdens concurrentie assays), positieve controles (controle kralen gekoppeld aan fusion-tag alleen toegevoegd tijdens concurrentie assays) en lysis controles (voor cytotoxiciteit experimenten). Inoculeer 5 ml marine LB (MLB) cultuur met een verse kolonie van V. parahaemolyticus en te groeien O / N bij 30 ° C, schudden. Bereid voldoende kraal gekoppeld MAM, zoals beschreven in hoofdstuk 1 (koppeling). Zorg voor 100 ml van 10x kraal voorraad per putje. Competitietest: Op de dag van de competition experiment, het meten van de OD 600 van de bacteriecultuur. Bereid infectie media door verdunning bacterieculturen in kleurloze DMEM zonder toevoegingen, voorverwarmd tot 37 ° C, bevattende 10% v / v kralensuspensie (hetzij adhesine-gekoppelde of controle korrels), een MOI van 10. bereiden 1 ml geven / goed en 10-20% overmaat volume per monster. Opmerking: Om de hierboven vermelde voorwaarden (24-well plaat, V. parahaemolyticus, MOI 10), de nodige volume O / N kweek wordt toegevoegd per putje (ml / ml) wordt berekend als 3 / OD 600 van de kweek. Zo wordt 1 ml van infectiemedium bevatten typisch 100 ml kralensuspensie, enkele ml bacteriekweek en worden aan 1 ml met kleurloze, niet aangevulde DMEM. Verwijder oude medium uit de putjes en spoel gekweekte HeLa cellen door toevoeging van 1 ml steriel PBS voorverwarmd tot 37 ° C aan elk putje. Verwijder PBS en voeg 1 ml van de infectie medium per well. Ook het opzetten van de controles, door het toevoegen van oplossingen containing controlekorrels en bacteriën (positieve controle) of adhesine kralen en geen bacteriën (negatieve controles) of DMEM met 0,1% Triton X-100 (lysis control, alleen nodig voor cytotoxiciteit metingen). Incubeer de plaat in een weefselkweek incubator bij 37 ° C voor de gewenste tijdsduur (bijvoorbeeld 4 uur op cytotoxiciteit metingen of 1 uur voor hechting metingen). Opmerking: Zowel bacteriële hechting en cytotoxiciteit op gastheercellen kunnen worden gebruikt als read-outs voor de effectiviteit van remming. Wanneer de tijdstippen van cytotoxiciteit en adhesie afmetingen samenvallen, kunnen beide testen worden uitgevoerd met monsters van dezelfde put, aangezien cytotoxiciteit wordt bepaald volgens de kweeksupernatant en hechting assays monsters afkomstig uit het resterende cellaag. Cytotoxiciteit metingen: Bij bepaalde tijdstippen (bv 4 uur na infectie), verwijder drie keer 200 ml van elke 24-well en transfer naareen 96-wells plaat. Spin 96-well platen bij 1500 xg, 5 min en overdracht 100 ml van elk putje in een verse 96-well plaat. Voeg 100 ml van het medium tijdens Infectieproeven verse putjes van de 96-well plaat in drievoud (deze worden gebruikt als blanco's). Voer de lactaat dehydrogenase (LDH) afgifte assay met een LDH cytotoxiciteit detectiekit en de instructies van de fabrikant. Kort Bereken de hoeveelheid reagentia die nodig in stappen van 25 (bijvoorbeeld als 62 monsters te meten, maakt genoeg reagens mix voor 75 enzovoort). Bijvoorbeeld, voor 100 monsters, meng 11,25 ml reagens A met 250 ul reagens B. omkeren, niet vortex schuimvorming te voorkomen. Doe het mengsel in een reservoir te kunnen pipet met meerdere kanalen pipet. Voeg 100 ul reagens mengsel aan elk monster. Incubeer plaat bij kamertemperatuur en lees absorptie bij 490 nm op een plaatlezer bij 10, 20, 30 min. </li> Analyseer de gegevensset waarbij de absorptie van de lysis controlemonster is hoog, maar nog steeds binnen het lineaire bereik van de plaatlezer (typisch 2-3 absorptie-eenheden). Express resultaten% cytotoxiciteit, volgens de formule voor de conversie: Meting van de bacteriële hechting: Bij bepaalde tijdstippen (bijvoorbeeld 1 uur na infectie), verwijder media uit de cel laag. Grondig de cellaag met steriel, voorverwarmd PBS (minstens 3-4 wasbeurten van 1 ml PBS elk) aan een niet-aangesloten cellen te verwijderen. Lyse gastheercellen door toevoeging van 1 ml van een steriele 1% v / v Triton X-100-oplossing in PBS per well. Incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende 5 min. Pipetteer elk monster en neer meerdere malen alvorens de inhoud van elk putje met 1,5 ml buisjes scheiden. Bereid 10-voudige seriële verdunningen van monstersin steriele PBS (bv gebruiken 100 ml monster en 900 ml PBS). Plaat 100 ml van elk monster op MLB agar en verspreiden met behulp van een cel spreader. Optimaliseren die verdunningen aan plaat afhankelijk van de bacteriestammen en tijdstip. Opmerking: Voor de beschreven experimentele opstelling, 10 5 of 10 6-voudige verdunningen geven een geschikt aantal CFU's. Incubeer de platen bij 37 ° CO / N en sommen bacteriën door kolonie telling.