De alta resolución de cuantificación del comportamiento guiado Olor en<em> Drosophila melanogaster</em> Uso de la<em> Flywalk</em> Paradigma

El objetivo primordial de cualquier investigación neuroethological es establecer una relación de causalidad entre los estados de actividad de neuronas individuales o circuitos neuronales y el comportamiento de un organismo. Para lograr este objetivo la actividad neuronal y el comportamiento debe ser monitoreado en condiciones de estímulo idénticas y estas condiciones de estímulo debería idealmente ser similares a los del sistema nervioso bajo escrutinio evolucionado para darle sentido. Particularmente cuando se trata de bioensayos de comportamiento, estos requisitos históricamente han demostrado ser muy exigente en Drosophila melanogaster neuroetología olfativo.

Una vez liberado de la fuente, plumas olor rompen rápidamente en filamentos delgados con difusión turbulenta provocada por el movimiento del aire es el principal determinante de la distribución de olor ^1. Como resultado, un insecto navegando hacia una fuente de olor experimenta estimulación intermitente con paquetes de olor intercalados con intervalos variables de aire limpio. Ambas cosascaminar y los insectos voladores – incluyendo Drosophila – se han demostrado para explotar este régimen estimulación intermitente para la navegación por el aumento en ceñida al encuentro penacho y predominantemente movimiento transversal del viento en la ausencia de olores ^{2 – 5.} Considerando que los procedimientos de estimulación en experimentos fisiológicos imitar en gran medida los de un insecto puede experimentar en su entorno natural o bien proporcionando bocanadas individuales de olores intercalados con períodos prolongados de aire limpio o secuencias de estimulación dinámicos ^{6 – 11,} muchos bioensayos de comportamiento utilizados en Drosophila neuroetología tales como ensayo TRAP , arenas en campo abierto o T-laberinto confían en olor-gradientes de ^{12 – 15.} Sin embargo, debido a los gradientes de olor, por definición, son variables en la concentración dependiendo de la distancia desde la fuente de olor, un comportamiento particular no puede atribuirse a una concentración de olor precisa el uso de estos paradigmas. Además, la pendiente deun gradiente olor depende fundamentalmente de las propiedades fisicoquímicas de la sustancia odorífera. Un gradiente de un compuesto muy volátil será menos profunda que la creada por un compuesto menos volátil y por lo tanto también más difíciles de rastrear para un organismo basándose en la medición de diferencias de concentración en el espacio como el único medio de navegación ^{16 – 20,} que puede conducir a una interpretación errónea de las preferencias olfativas particularmente en ensayos de elección. Este efecto también es muy perjudicial cuando se investiga el comportamiento hacia mezclas de olores, ya que conduce a diferentes relaciones de componentes de mezcla en cada punto en el espacio, por lo que una vez más se opone a una clara correlación entre la fisiología y el comportamiento.

Mientras moscas del vinagre tienden a agregarse en la fermentación de la fruta, que son solitarias en su navegación hacia fuentes de alimento y sitios de oviposición. Sin embargo, en lugar de pruebas de los animales individuales muchos paradigmas conductuales utilizadas en Drosophila neuroethología examinar el comportamiento de olores guiada por cohortes de moscas y la atracción se anotó como la fracción de moscas que eligen el olor más de un estímulo de control. Estos experimentos de cohortes han contribuido en gran medida a la comprensión de neuroetología mosca y muchas de las observaciones formuladas por el uso de ellos podría ser confirmado en experimentos de una sola mosca. Sin embargo, se ha observado que las moscas pueden influir en cada decisión other's ²¹ y en casos extremos la evaluación de un olor puede pasar de la indiferencia a la evitación en función de la densidad de población ^22. Además, los resultados de este tipo de experimentos proporcionan a menudo sólo el punto final de una secuencia de decisiones de comportamiento en lugar de observar lo que está haciendo la marcha mientras se está haciendo, lo que sería deseable cuando se intenta correlacionar el comportamiento con la actividad neuronal. Estos experimentos de cohortes en vez de baja resolución contrastan con alta resolución de los métodos de una sola mosca tales como arenas de vuelo atados y cintas de correr que permitenpara una observación directa de las respuestas de comportamiento en el momento del estímulo se presenta ^20,23,24. Sin embargo, los experimentos de cohortes siguen siendo populares, porque son muy eficientes y proporcionan resultados sólidos, incluso a baja comparativamente tamaños de muestra, porque la variabilidad inter-individual y entre ensayos están parcialmente en promedio debido a la observación de las poblaciones durante períodos prolongados de tiempo. Mientras vuelo atado cinta de correr y probablemente proporcionan el estándar de oro en relación con la presentación del estímulo y la resolución temporal, las arenas utilizadas están diseñados para los animales individuales y por lo tanto es mucho tiempo para obtener el tamaño de muestra necesario para un análisis estadístico. Recientemente se han desarrollado varios otros enfoques que permiten una adquisición eficiente de los datos de comportamiento de alta resolución en combinación con un régimen de estímulo bien definido. Estos incluyen sin supervisión seguimiento 3D de múltiples moscas del vinagre en un túnel de viento en combinación con un modelo 3D preciso del olor penacho ⁵ </sup>, el seguimiento de múltiples moscas individuales en cámaras elección suministradas con corrientes de aire de ambos lados ^{25 y} el paradigma Flywalk ^26.

En Flywalk, 15 moscas individuales están situados en pequeños tubos de vidrio y monitoreados continuamente por una cámara aérea en condiciones de luz roja. Los olores se añaden a una corriente de aire continua de 20 cm / seg y se desplazan por los tubos de vidrio a una velocidad constante. La corriente de aire se humidifica pasándolo a través de botellas de 250 ml que contenían agua destilada (humidificadores) antes de entrar en el sistema de suministro de olor. Las posiciones flies' se registran dentro de una región cuadrada de interés (ROI) que abarca la mayor parte de la longitud de los tubos de olor (pero excluyendo los bordes exteriores de los tubos (aproximadamente 5 mm en cada lado), donde las moscas no pueden moverse más hacia arriba o hacia a favor del viento) en la época de presentación de olor (Figura 1 A, B). Fly identidades se mantienen constantes por el sistema de seguimiento de turante el experimento sobre la base de sus Y-posiciones (es decir, sus límites de tubo de vidrio). Olor estimulación se consigue utilizando un dispositivo de estímulo multi-componente que permite la presentación de hasta 8 olores individuales y todas las mezclas posibles de los mismos ^26,29 (Figura 1B). El curso de un experimento se controla por un ordenador que regula el sistema de suministro de olor y la recolección de la temperatura y la humedad información (ordenador 1, la Figura 1C). Este equipo también controla un datalogger (iniciar / detener la grabación) en un segundo equipo que rastrea continuamente las posiciones de la mosca a 20 fotogramas por segundo (ordenador 2). Vuela posiciones, estado de la válvula de olor (es decir, el tiempo-punto de apertura de la válvula), el olor de identificación, la temperatura y la humedad alrededor de los ciclos de estimulación olor se registran en el ordenador 2. De esta manera la información sobre el olor y volar posiciones están sincronizados y se exportan como .csv archivos que se pueden procesar más y analizados mediante rutinas de análisis personalizadas escrita. Porquetodo el sistema es controlado por ordenador, ninguna intervención humana es necesaria durante una sesión experimental.