JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neurosciences

Üç boyutlu görüntüleme ve mitokondri içinde insan Intraepidermal sinir lifleri analizi

Published: September 29, 2017
doi:
10.3791/53369
, , ,
1University of Michigan Medical School, 2Department of Neurology,University of Michigan, 3Department of Internal Medicine,University of Michigan

Summary

Bu iletişim kuralı görselleştirmek ve sinir özgü mitokondri ölçmek için üç boyutlu (3D) görüntüleme ve çözümleme teknikleri kullanır. Teknikleri bir floresan sinyal başka bir floresan sinyalinden gelen verilerin bir alt kümesini yalıtmak için kullanıldığı diğer durumlar için geçerlidir.

Abstract

Bu iletişim kuralının amacı mitokondri içinde intraepidermal sinir lifleri incelemektir. Bu nedenle, 3D görüntüleme ve analiz teknikleri sinir özgü mitokondri yalıtmak ve duyusal sinir distal ucu mitokondri hastalığı kaynaklı değişikliklere değerlendirmek için geliştirilmiştir. Protokol Floresans immünhistokimya, confocal mikroskobu ve görselleştirmek ve sinir özgü mitokondri ölçmek için 3D görüntü analiz teknikleri birleştirir. Detaylı parametreleri yordamlarda sinir özgü mitokondri yalıtmak için bu teknikleri kullanmayı gösteren somut bir örnek vermek için tanımlanır. Hangi sinirler ve mitokondri yeşil ve kırmızı floresan sinyali ile sırasıyla görselleştirmek için dolaylı ayirt tarafından izledi biyopsi, deri doku bölümleri içinde mitokondrial sinyalleri yumruk ve antikorlar sinir etiketlemek için kullanıldı. Z-serisi görüntüleri confocal mikroskobu ile satın alınan ve 3D analiz yazılımı işlemek ve sinyalleri analiz etmek için kullanıldı. İçinde açıklanan tam parametreleri takip için gerekli değildir, ancak boyama boyunca, toplama ve analizi adımları seçilmiş olanlar ile tutarlı olması önemlidir. Bu iletişim kuralı bir floresan sinyal aksi Yalnız çalışmak imkansız diğer sinyalleri yalıtmak için kullanıldığı çok çeşitli koşullar uygulanabilir olduğunu gücüdür.

Introduction

Mitokondri hücre enerji, kalsiyum ve nekrotik düzenleyen ve apoptotik hücre ölüm1,2,3tampon üreten dahil önemli hücresel işlevler hizmet. Sinir sistemi nöronlar hücresel enerji yüksek derecede adenozin trifosfat (ATP) formunda oluşturmak düşündüren vücut4 mitokondrial solunum ile karşılaştırıldığında yüksek bir metabolizma hızı vardır. Bir sürü kanıt belgeleri nöronal işlevleri ATP5, özellikle de sinapslarda6bağlıdır. Bu nedenle, mitokondri nöronlar içinde dağılımı önemlidir.

Bir sürü bilgi bu trafiği ve nöronal mitokondri rıhtım göstermiştir son 10 yıl içinde son derece düzenlenmiştir. Motor proteinler mitokondri nöron boyunca belirli hücresel kompartmanlarda için dağıtma katılmaktadırlar. Nöronlar proje akson ve dendrites uzakta soma mitokondri kaçakçılığı özellikle önemlidir. Kinesin motor proteinler öncelikle anterograd (soma) uzak mitokondri mikrotübüller dinein motor proteinler doğrudan (soma doğru) retrograd hareketliliği7,8,9 süre boyunca, kaçakçılığı doğrudan , 10. böyle bir mitokondri zar potansiyeli ve varlığı ve mitokondrial kaçakçılığı11,12,13yönünü etkileyen impuls iletim hücresel sinyalleri vardır.

Mitokondri taşıma yanı sıra, mitokondri ve Ranvier düğümleri ve sinapslarda8,14, gibi yüksek enerji talepleri belirli hücresel kompartmanlarda için yerelleştirmek için özel proteinler vardır 17. aslında, mitokondri içinde aksonlar hareketli9,13,18çoğu. Özel proteinler gibi syntaphilin çapa mitokondri mikrotübüller diğer proteinler çapa mitokondri aktin sitoiskeleti19–21ise akson boyunca için. Büyüme faktörleri ve kalsiyum gibi iyonları mitokondri hareket onları gerekli21,22,23nerede olduklarını bölgelerine yerelleştirmek için kesilmesi desteklemek için rapor edilmiştir.

Birlikte ele alındığında, ticareti ve mitokondri yerleştirme nöronlar için düzgün bakımından çok önemlidir. Bu destek, Alzheimer hastalığı, amyotrofik lateral skleroz, Charcot Marie Tooth hastalığı, Huntington hastalığı, herediter Spastik dahil olmak üzere çeşitli nörolojik koşullar ile ilişkili mitokondrial kaçakçılığı bozulma olmuştur paraparesis ve optik Atrofi15,24,25,26,27. Son yıllarda yapılan çalışmalarda diyabetik nöropati, diyabet28,29,30ile,31 ilişkili duyu kaybı için potansiyel bir mekanizma olarak mitokondrial disfonksiyon ve patoloji üzerinde odaklanmıştır ,32,33. Diyabet mitokondri Kutanöz sinir biten duyusal projeksiyonlar içinde dağıtım değiştirir hipotezdir. Bu nedenle, bir teknik görselleştirmek ve mitokondri içinde intraepidermal sinir lifleri (IENFs), dorsal kök gangliyon duyusal afferents distal ipuçları ölçmek için geliştirilmiştir. Teknik Floresans immünhistokimya özel mitokondrial ve sinir lifi etiket sinir özgü dağılımını ölçmek için sinyalleri güçlü 3D görüntü analiz yazılımı ile confocal mikroskobu z serisi satın alma ile birleştirir. Bu hedefe ulaşmak için insan Kutanöz punch biyopsi üzerinden mitokondri.

Protocol

(Salt Lake City, UT) Utah Üniversitesi diyabet Merkezi’nde büyük topluluk tabanlı birinci basamak sağlık ağdan işe konulardan elde edilen deri punch biyopsi. Bu çalışma Michigan Üniversitesi Kurumsal değerlendirme Komitesi tarafından onaylanmış ve Helsinki Deklarasyonu ilkelerinin ile uyulması. Aydınlatılmış onam test önce her konudan elde edilen yazılı. 1. Floresans immünhistokimya hazırla punch biyopsi intraepidermal Sinir lifi immünhistokimya i…

Representative Results

Görselleştirme ve mitokondri içinde insan IENFs miktar Floresans immünhistokimya sinirler, mitokondri ve çekirdekleri görselleştirmek için Çoklu sinyaller insan cilt biyopsileri içinde eşzamanlı etiketleme için sağlar. 96-şey plaka immünhistokimya yordamdaki adımları düzenlemek için kullanışlı bir yol var. Şekil 1 bu kadar çözümler 12 aşamalarında işlen…

Discussion

Bu iletişim kuralı izole etmek, ölçmek ve boyutu ve sinir özgü mitokondri içinde IENFs 3D insan cilt biyopsileri üzerinden dağıtımını çözümlemek için tasarlanmıştır. Protokolünde çeşitli kritik adımlar vardır. Serbest dalgalanma Floresans immünhistokimya leke ve her örneğinde, Araştırma araştırma44,45için daha çok yönlü bir metodoloji sağlayan Çoklu sinyaller çözümlemek için tasarlanmıştır. Bu yordamı confocal mikrosk…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser Ulusal kurumları sağlık hibe K08 NS061039-01A2, Nöroloji araştırma için Program tarafından desteklenen & keşif ve A. Alfred Taubman Tıbbi Araştırma Enstitüsü Michigan Üniversitesi’nde. Bu eser morfoloji ve görüntü analiz çekirdek Michigan diyabet araştırma merkezinin Ulusal Sağlık Enstitüleri Grant 5 P 90 DK-20572 diyabet Ulusal Enstitüsü ve sindirim ve böbrek hastalıkları tarafından finanse edilen kullanılır. Yazarlar insan deri örnekleri onların cömert bağış için J. Robinson Singleton ve A. Gordon Smith (Utah Üniversitesi) teşekkür etmek istiyorum.

Materials

2% Zamboni's Fixative Newcomer Supply, Middleton, WI  1459A 2% paraformaldehyde, 0.2% saturated picric acid in phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4
10X Phosphate Buffered Saline (PBS)  Fisher Scientific, Pittsburgh, PA BP399-4 To make up 1X PBS
Image-iT FX Signal Enhancer ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts I36933 enhances Alexa Fluor dye signals by reducing nonspecific binding
Anti-Protein Gene Product 9.5 Antibody (Rabbit Polyclonal) Proteintech Group Inc. Rosemont, IL 14730-1-AP abbreviated as PGP9.5, replaces discontinued AbD Serotec (Cat. No. 7863-0504) antibody
Anti-Pyruvate Dehydrogenase E2/E3bp Antibody (Mouse Monoclonal) abcam, Cambridge, MA ab110333 abbreviated as PDH
Goat anti-mouse Secondary antibody Alexa Fluor 594 conjugate ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts A-11034 red-fluorescent conjugated secondaryantibody
Goat anti-rabbit Secondary antibody Alexa Fluor 488 conjugate ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts A-11032 green-fluorescent conjugated secondaryantibody
Albumin, from Bovine Serum Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A7906-100 abbreviated as BSA
Triton X- 100 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO T9284 abbreviated as TX-100
0.22 µm Filter EMD Millipore, Billerica
MA		 MILLEX GP SLGP 033NS 0.22 µm Millipore filter
Parafilm M Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 13-374-10 Curwood Wisconsin LLC Parafilm M (PM-996)
Non-calibrated Loop Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 22-032092 inoculating Loop by Decon LeLoop (MP 199-25)
96-well Assay Plate Corning Incorporated, Corning, NY 3603 96-well flat bottom plate
Prolong Gold antifade reagent with DAPI ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts P-36931 DAPI staining of nuclei
Microscope Cover Glass 50 x 24 mm Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 12-544E Coverslips
Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 12-550-15 Microscope Slides
Leica SP5 Laser Scanning Confocal Microscope Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL SP5 Confocal Microscope
Volocity x64 Software  Perkin Elmer, Waltham , MA version 4.4.0 Volocity software is used for Steps 3.1 and 3.2 in the protocol for image processing
Imaris x64 3 Dimensional Analysis Software Bitplane, Concord, MA version 7.7.1 Imaris software is used for Steps 3.3 through 3.5 in the protocol for image analysis
Excel Microsoft, Redmond, WA version Office 2013 Excel spreadsheet software is used for Step 3.6 in the protocol to summarize morphometric features
Optimum Cutting Temperature Compound Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA 4583 abbreviated as OCT
Leica Cryostat Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL CM1850 Cryostat for cutting 50 µm sections
CellLight Mitochondria-GFP, BacMam 2.0 ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts C10600 Used as a postive control to label mitochondria with a green fluorescent signal
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nicholls, D. G., Budd, S. L. Mitochondria and neuronal survival. Physiol Rev. 80 (1), 315-360 (2000).
  2. Chan, D. C. Mitochondrial fusion and fission in mammals. Ann Rev Cell Dev Biol. 22, 79-99 (2006).
  3. Ni, H. M., Williams, J. A., Ding, W. X. Mitochondrial dynamics and mitochondrial quality control. Redox Biol. 4 (C), 6-13 (2015).
  4. Mink, J. W., Blumenschine, R. J., Adams, D. B. Ratio of central nervous system to body metabolism in vertebrates: its constancy and functional basis. Am J Physiol. 241 (3), R203-R212 (1981).
  5. Ames, A. CNS energy metabolism as related to function. Brain Res Brain Res Rev. 34 (1-2), 42-68 (2000).
  6. Harris, J. J., Jolivet, R., Attwell, D. Synaptic energy use and supply. Neuron. 75 (5), 762-777 (2012).
  7. Hollenbeck, P. J. The pattern and mechanism of mitochondrial transport in axons. Front Biosci. 1, d91-d102 (1996).
  8. Cai, Q., Sheng, Z. H. Mitochondrial transport and docking in axons. Exp Neurol. 218 (2), 257-267 (2009).
  9. Schwarz, T. L. Mitochondrial trafficking in neurons. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (6), (2013).
  10. Saxton, W. M., Hollenbeck, P. J. The axonal transport of mitochondria. J Cell Sci. 125 (Pt 9), 2095-2104 (2012).
  11. Sajic, M., et al. Impulse conduction increases mitochondrial transport in adult mammalian peripheral nerves in vivo. PLoS Biol. 11 (12), e1001754 (2013).
  12. Ohno, N., et al. Myelination and axonal electrical activity modulate the distribution and motility of mitochondria at CNS nodes of ranvier. J Neurosci. 31 (20), 7249-7258 (2011).
  13. Miller, K. E., Sheetz, M. P. Axonal mitochondrial transport and potential are correlated. J Cell Sci. 117, 2791-2804 (2004).
  14. Macaskill, A. F., et al. Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses. Neuron. 61 (4), 541-555 (2009).
  15. Sheng, Z. H., Cai, Q. Mitochondrial transport in neurons: impact on synaptic homeostasis and neurodegeneration. Nat Rev Neurosci. 13 (2), 77-93 (2012).
  16. Berthold, C. H., Fabricius, C., Rydmark, M., Andersen, B. Axoplasmic organelles at nodes of Ranvier. I. Occurrence and distribution in large myelinated spinal root axons of the adult cat. J Neurocytol. 22 (11), 925-940 (1993).
  17. Fabricius, C., Berthold, C. H., Rydmark, M. Axoplasmic organelles at nodes of Ranvier. II. Occurrence and distribution in large myelinated spinal cord axons of the adult cat. J Neurocytol. 22 (11), 941-954 (1993).
  18. Hollenbeck, P. J., Saxton, W. M. The axonal transport of mitochondria. J Cell Sci. 118 (Pt 23), 5411-5419 (2005).
  19. Ohno, N., et al. Mitochondrial immobilization mediated by syntaphilin facilitates survival of demyelinated axons. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (27), 9953-9958 (2014).
  20. Kang, J. S., et al. Docking of axonal mitochondria by syntaphilin controls their mobility and affects short-term facilitation. Cell. 132 (1), 137-148 (2008).
  21. Chada, S. R., Hollenbeck, P. J. Nerve growth factor signaling regulates motility and docking of axonal mitochondria. Curr Biol. 14, 1272-1276 (2004).
  22. Yi, M., Weaver, D., Hajnoczky, G. Control of mitochondrial motility and distribution by the calcium signal: a homeostatic circuit. J Cell Biol. 167 (4), 661-672 (2004).
  23. Saotome, M., et al. Bidirectional Ca2+-dependent control of mitochondrial dynamics by the Miro GTPase. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (52), 20728-20733 (2008).
  24. Schon, E. A., Przedborski, S. Mitochondria: the next (neurode)generation. Neuron. 70 (6), 1033-1053 (2011).
  25. Petrozzi, L., Ricci, G., Giglioli, N. J., Siciliano, G., Mancuso, M. Mitochondria and neurodegeneration. Biosci Rep. 27 (1-3), 87-104 (2007).
  26. Maresca, A., la Morgia, C., Caporali, L., Valentino, M. L., Carelli, V. The optic nerve: a "mito-window" on mitochondrial neurodegeneration. Mol Cell Neurosci. 55, 62-76 (2013).
  27. Su, B., et al. Abnormal mitochondrial dynamics and neurodegenerative diseases. Biochim Biophys Acta. 1802 (1), 135-142 (2010).
  28. Vincent, A. M., et al. Mitochondrial biogenesis and fission in axons in cell culture and animal models of diabetic neuropathy. Acta Neuropathol. 120 (4), 477-489 (2010).
  29. Leinninger, G. M., et al. Mitochondria in DRG neurons undergo hyperglycemic mediated injury through Bim, Bax and the fission protein Drp1. Neurobiol Dis. 23, 11-22 (2006).
  30. Leinninger, G. M., Edwards, J. L., Lipshaw, M. J., Feldman, E. L. Mechanisms of disease: mitochondria as new therapeutic targets in diabetic neuropathy. Nat Clin Pract Neurol. 2, 620-628 (2006).
  31. Edwards, J. L., et al. Diabetes regulates mitochondrial biogenesis and fission in mouse neurons. Diabetologia. 53 (1), 160-169 (2010).
  32. Fernyhough, P., Roy Chowdhury, S. K., Schmidt, R. E. Mitochondrial stress and the pathogenesis of diabetic neuropathy. Expert Rev Endocrinol Metab. 5 (1), 39-49 (2010).
  33. Schmidt, R. E., Green, K. G., Snipes, L. L., Feng, D. Neuritic dystrophy and neuronopathy in Akita (Ins2(Akita)) diabetic mouse sympathetic ganglia. Exp Neurol. 216 (1), 207-218 (2009).
  34. Penna, G., et al. Human benign prostatic hyperplasia stromal cells as inducers and targets of chronic immuno-mediated inflammation. J Immunol. 182 (7), 4056-4064 (2009).
  35. Lentz, S. I., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In Vitro. J Histochem Cytochem. 58 (2), 207-218 (2010).
  36. Glas, U., Bahr, G. F. Quantitative study of mitochondria in rat liver. Dry mass, wet mass, volume, and concentration of solids. J Cell Biol. 29 (3), 507-523 (1966).
  37. Bertoni-Freddari, C., et al. Morphological plasticity of synaptic mitochondria during aging. Brain Research. 628 (1-2), 193-200 (1993).
  38. Kaasik, A., Safiulina, D., Zharkovsky, A., Veksler, V. Regulation of mitochondrial matrix volume. Am J Physiol. 292 (1), C157-C163 (2007).
  39. Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. Imaging axonal transport of mitochondria in vivo. Nat Meth. 4 (7), 559-561 (2007).
  40. Park, J. Y., et al. Mitochondrial swelling and microtubule depolymerization are associated with energy depletion in axon degeneration. Neurosciences. 238, 258-269 (2013).
  41. Court, F. A., Coleman, M. P. Mitochondria as a central sensor for axonal degenerative stimuli. Trends Neurosci. 35 (6), 364-372 (2012).
  42. Baloh, R. H. Mitochondrial dynamics and peripheral neuropathy. Neuroscientist. 14 (1), 12-18 (2008).
  43. Chowdhury, S. K., Smith, D. R., Fernyhough, P. The role of aberrant mitochondrial bioenergetics in diabetic neuropathy. Neurobiol Dis. 51, 56-65 (2013).
  44. Kennedy, W. R., Wendelschafer-Crabb, G., Johnson, T. Quantitation of epidermal nerves in diabetic neuropathy. Neurology. 47, 1042-1048 (1996).
  45. Lauria, G., et al. EFNS guidelines on the use of skin biopsy in the diagnosis of peripheral neuropathy. Eur J Neurol. 12 (10), 747-758 (2005).
  46. Lauria, G., et al. European Federation of Neurological Societies/Peripheral Nerve Society Guideline on the use of skin biopsy in the diagnosis of small fiber neuropathy. Report of a joint task force of the European Federation of Neurological Societies and the Peripheral Nerve Society. Eur J Neurol. 17 (7), e944-e909 (2010).
  47. Umapathi, T., Tan, W. L., Tan, N. C. K., Chan, Y. H. Determinants of epidermal nerve fiber density in normal individuals. Muscle Nerve. 33 (6), 742-746 (2006).
  48. Lauria, G., et al. Epidermal innervation: changes with aging, topographic location, and in sensory neuropathy. J Neurol Sci. 164 (2), 172-178 (1999).
  49. Lauria, G., et al. Intraepidermal nerve fiber density at the distal leg: a worldwide normative reference study. J Peripher Nerv Syst. 15 (3), 202-207 (2010).
  50. Hamid, H. S., et al. Hyperglycemia- and neuropathy-induced changes in mitochondria within sensory nerves. Ann Clin Transl Neurol. 1 (10), 799-812 (2014).

Tags

3D ImagingMitochondriaIntraepidermal Nerve FibersFluorescence ImmunohistochemistryPGP9.5PDHSecondary AntibodiesSignal EnhancementEpidermal Nerve FibersNeurological Complications

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Hamid, H. S., Hayes, J. M., Feldman, E. L., Lentz, S. I. Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers. J. Vis. Exp. (127), e53369, doi:10.3791/53369 (2017).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image