Driedimensionale beeldvorming en analyse van Mitochondria binnen menselijke Intraepidermal zenuwvezels
Summary
Dit protocol maakt gebruik van driedimensionale (3D) beeldvorming en analyse technieken om te visualiseren en te kwantificeren van zenuw-specifieke mitochondriën. De technieken zijn van toepassing op andere situaties waar een fluorescent signaal wordt gebruikt voor het isoleren van een subset van gegevens uit een ander fluorescent signaal.
Abstract
Het doel van dit protocol is het bestuderen van de mitochondriën binnen intraepidermal zenuwvezels. Daarom, 3D imaging en analyse technieken werden ontwikkeld om isoleren van zenuw-specifieke mitochondriën en evalueren van ziekte-geïnduceerde veranderingen van de mitochondriën in de distale uiteinde van sensorische zenuwen. Het protocol combineert fluorescentie immunohistochemistry, confocal microscopie en 3D beeld analysetechnieken om te visualiseren en te kwantificeren van zenuw-specifieke mitochondriën. Gedetailleerde parameters worden gedefinieerd in de procedures om een concreet voorbeeld van het gebruik van deze technieken te isoleren van de zenuw-specifieke mitochondriën. Antilichamen werden gebruikt voor het label van de zenuw en mitochondriale signalen binnen weefselsecties van huid punch biopsieën, die werd gevolgd door indirecte immunofluorescentietest te visualiseren zenuwen- en mitochondriën met een groene en rode fluorescerende signaal respectievelijk. Z-serie beelden werden verkregen met confocale microscopie en 3D analysesoftware werd gebruikt voor het verwerken en analyseren van de signalen. Het is niet nodig om te volgen de exacte parameters beschreven binnen, maar het is belangrijk overeenstemming te zijn met degene die zijn gekozen door de kleuring, acquisitie en analyse stappen. De sterkte van dit protocol is dat is van toepassing op een breed scala aan omstandigheden waar één fluorescent signaal wordt gebruikt voor het isoleren van andere signalen dat anders onmogelijk zijn zou om alleen te bestuderen.
Introduction
Mitochondriën dienen vitale cellulaire functies waarin het produceren van energie van de cel, calcium, en de regulering van necrotisch en de apoptotic cel dood1,2,3te bufferen. Het zenuwstelsel heeft een hoge stofwisseling ten opzichte van het lichaam4 suggereren dat neuronen een hoge mate van cellulaire energie in de vorm van adenosinetrifosfaat (ATP genereren) door middel van mitochondriale ademhaling. Een heleboel documenten van bewijs dat neuronale functies zijn afhankelijk van ATP5, met name op de synapsen6. Daarom is de verdeling van de mitochondriën binnen neuronen is belangrijk.
In de afgelopen 10 jaar die een heleboel informatie is gebleken dat de drugshandel en het couperen van neuronale mitochondriën is sterk gereguleerd. Motor eiwitten zijn betrokken bij de verdeling van de mitochondriën naar specifieke cellulaire compartimenten gedurende het neuron. Handel in mitochondriën is vooral belangrijk omdat de neuronen project axonen en dendrites ver weg van het soma. Kinesin motor eiwitten directe voornamelijk anterograde (weg van het soma) handel in mitochondriën langs microtubuli terwijl dynein motor eiwitten directe retrograde (richting het soma) beweeglijkheid7,8,9 , 10. er zijn cellulaire signalen zo’n Mitochondriale membraanpotentiaal en geleiding van de impuls die invloed hebben op de aanwezigheid en de richting van mitochondriale mensenhandel11,12,13.
Naast het vervoer van mitochondriën, zijn er gespecialiseerde eiwitten te lokaliseren mitochondriën naar specifieke cellulaire compartimenten die hoge energie-eisen, zoals de knopen van Ranvier en synapsen8,14, hebben 17. In feite de meeste mitochondria binnen axonen zijn niet-sporenvormende9,13,18. Gespecialiseerde eiwitten zoals syntaphilin anker mitochondriën tot microtubuli langs axonen terwijl andere eiwitten anker mitochondriën tot aan de actine cytoskelet19––21. Groeifactoren en ionen zoals calcium zijn ter ondersteuning van de stopzetting van de mitochondriën verkeer te lokaliseren hen aan regio’s waar ze de benodigde21,22,23zijn gemeld.
Samen genomen, zijn de mensenhandel en docking van mitochondriën van vitaal belang voor de werking van neuronen. Ter ondersteuning van dit, verstoring van de mitochondriale mensenhandel is in verband gebracht met verschillende neurologische aandoeningen waaronder de ziekte van Alzheimer, Amyotrofische laterale sclerose, ziekte van Charcot-Marie-Tooth, ziekte van Huntington, erfelijke spastische paraparese en optische atrofie15,24,25,26,27. Recente studies hebben gericht op de mitochondriale dysfunctie en pathologie als een potentiële mechanisme voor diabetische neuropathie, de zintuiglijke verlies geassocieerd met diabetes28,29,30,31 3332, ,. De hypothese is dat diabetes de verdeling van de mitochondriën in de sensorische prognoses van cutane zenuw eindigt wijzigt. Daarom werd een techniek ontwikkeld om te visualiseren en te kwantificeren van mitochondria binnen de intraepidermal zenuwvezels (IENFs), de distale uiteinden van de achterwortelganglia ganglion sensorische afferents. De techniek combineert fluorescentie immunohistochemistry van specifieke mitochondriale en zenuw fiber etiketten met confocale microscopie z-serie overname van signalen met de software van de analyse van de krachtige 3D-beeld voor het meten van de verdeling van de zenuw-specifieke mitochondriën van menselijke cutane punch biopsieën om dit doel te bereiken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol is ontworpen om te isoleren, te kwantificeren en te analyseren, de grootte en de distributie van zenuw-specifieke mitochondria binnen IENFs in 3D van menselijke huid biopsieën. Er zijn verschillende kritische stappen in het protocol. De zwevende fluorescentie immunohistochemistry is ontworpen om vlekken en analyseren van meerdere signalen in elk monster, een meer veelzijdige methodologie voorziet exploratief onderzoek44,45. Deze procedure zorgt voor…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de nationale instituten van gezondheid subsidies K08 NS061039-01A2, het programma voor onderzoek van de neurologie & ontdekking, en het A. Alfred Taubman Medical Research Institute aan de Universiteit van Michigan. Dit werk gebruikt de morfologie en de afbeelding kern van de analyse van de Michigan Diabetes Research Center, gefinancierd door nationale instituten van gezondheid Grant 5P-90 DK-20572 van het nationale Instituut van Diabetes en de spijsverterings en nierziekten. De auteurs bedank J. Robinson Singleton en A. Gordon Smith (Universiteit van Utah) voor hun gulle donatie van menselijke huid monsters.
Materials
| 2% Zamboni's Fixative | Newcomer Supply, Middleton, WI | 1459A | 2% paraformaldehyde, 0.2% saturated picric acid in phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 |
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP399-4 | To make up 1X PBS |
| Image-iT FX Signal Enhancer | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | I36933 | enhances Alexa Fluor dye signals by reducing nonspecific binding |
| Anti-Protein Gene Product 9.5 Antibody (Rabbit Polyclonal) | Proteintech Group Inc. Rosemont, IL | 14730-1-AP | abbreviated as PGP9.5, replaces discontinued AbD Serotec (Cat. No. 7863-0504) antibody |
| Anti-Pyruvate Dehydrogenase E2/E3bp Antibody (Mouse Monoclonal) | abcam, Cambridge, MA | ab110333 | abbreviated as PDH |
| Goat anti-mouse Secondary antibody Alexa Fluor 594 conjugate | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | A-11034 | red-fluorescent conjugated secondaryantibody |
| Goat anti-rabbit Secondary antibody Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | A-11032 | green-fluorescent conjugated secondaryantibody |
| Albumin, from Bovine Serum | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A7906-100 | abbreviated as BSA |
| Triton X- 100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T9284 | abbreviated as TX-100 |
| 0.22 µm Filter | EMD Millipore, Billerica MA |
MILLEX GP SLGP 033NS | 0.22 µm Millipore filter |
| Parafilm M | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 13-374-10 | Curwood Wisconsin LLC Parafilm M (PM-996) |
| Non-calibrated Loop | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 22-032092 | inoculating Loop by Decon LeLoop (MP 199-25) |
| 96-well Assay Plate | Corning Incorporated, Corning, NY | 3603 | 96-well flat bottom plate |
| Prolong Gold antifade reagent with DAPI | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | P-36931 | DAPI staining of nuclei |
| Microscope Cover Glass 50 x 24 mm | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 12-544E | Coverslips |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 12-550-15 | Microscope Slides |
| Leica SP5 Laser Scanning Confocal Microscope | Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL | SP5 | Confocal Microscope |
| Volocity x64 Software | Perkin Elmer, Waltham , MA | version 4.4.0 | Volocity software is used for Steps 3.1 and 3.2 in the protocol for image processing |
| Imaris x64 3 Dimensional Analysis Software | Bitplane, Concord, MA | version 7.7.1 | Imaris software is used for Steps 3.3 through 3.5 in the protocol for image analysis |
| Excel | Microsoft, Redmond, WA | version Office 2013 | Excel spreadsheet software is used for Step 3.6 in the protocol to summarize morphometric features |
| Optimum Cutting Temperature Compound | Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA | 4583 | abbreviated as OCT |
| Leica Cryostat | Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL | CM1850 | Cryostat for cutting 50 µm sections |
| CellLight Mitochondria-GFP, BacMam 2.0 | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | C10600 | Used as a postive control to label mitochondria with a green fluorescent signal |
References
- Nicholls, D. G., Budd, S. L. Mitochondria and neuronal survival. Physiol Rev. 80 (1), 315-360 (2000).
- Chan, D. C. Mitochondrial fusion and fission in mammals. Ann Rev Cell Dev Biol. 22, 79-99 (2006).
- Ni, H. M., Williams, J. A., Ding, W. X. Mitochondrial dynamics and mitochondrial quality control. Redox Biol. 4 (C), 6-13 (2015).
- Mink, J. W., Blumenschine, R. J., Adams, D. B. Ratio of central nervous system to body metabolism in vertebrates: its constancy and functional basis. Am J Physiol. 241 (3), R203-R212 (1981).
- Ames, A. CNS energy metabolism as related to function. Brain Res Brain Res Rev. 34 (1-2), 42-68 (2000).
- Harris, J. J., Jolivet, R., Attwell, D. Synaptic energy use and supply. Neuron. 75 (5), 762-777 (2012).
- Hollenbeck, P. J. The pattern and mechanism of mitochondrial transport in axons. Front Biosci. 1, d91-d102 (1996).
- Cai, Q., Sheng, Z. H. Mitochondrial transport and docking in axons. Exp Neurol. 218 (2), 257-267 (2009).
- Schwarz, T. L. Mitochondrial trafficking in neurons. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (6), (2013).
- Saxton, W. M., Hollenbeck, P. J. The axonal transport of mitochondria. J Cell Sci. 125 (Pt 9), 2095-2104 (2012).
- Sajic, M., et al. Impulse conduction increases mitochondrial transport in adult mammalian peripheral nerves in vivo. PLoS Biol. 11 (12), e1001754 (2013).
- Ohno, N., et al. Myelination and axonal electrical activity modulate the distribution and motility of mitochondria at CNS nodes of ranvier. J Neurosci. 31 (20), 7249-7258 (2011).
- Miller, K. E., Sheetz, M. P. Axonal mitochondrial transport and potential are correlated. J Cell Sci. 117, 2791-2804 (2004).
- Macaskill, A. F., et al. Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses. Neuron. 61 (4), 541-555 (2009).
- Sheng, Z. H., Cai, Q. Mitochondrial transport in neurons: impact on synaptic homeostasis and neurodegeneration. Nat Rev Neurosci. 13 (2), 77-93 (2012).
- Berthold, C. H., Fabricius, C., Rydmark, M., Andersen, B. Axoplasmic organelles at nodes of Ranvier. I. Occurrence and distribution in large myelinated spinal root axons of the adult cat. J Neurocytol. 22 (11), 925-940 (1993).
- Fabricius, C., Berthold, C. H., Rydmark, M. Axoplasmic organelles at nodes of Ranvier. II. Occurrence and distribution in large myelinated spinal cord axons of the adult cat. J Neurocytol. 22 (11), 941-954 (1993).
- Hollenbeck, P. J., Saxton, W. M. The axonal transport of mitochondria. J Cell Sci. 118 (Pt 23), 5411-5419 (2005).
- Ohno, N., et al. Mitochondrial immobilization mediated by syntaphilin facilitates survival of demyelinated axons. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (27), 9953-9958 (2014).
- Kang, J. S., et al. Docking of axonal mitochondria by syntaphilin controls their mobility and affects short-term facilitation. Cell. 132 (1), 137-148 (2008).
- Chada, S. R., Hollenbeck, P. J. Nerve growth factor signaling regulates motility and docking of axonal mitochondria. Curr Biol. 14, 1272-1276 (2004).
- Yi, M., Weaver, D., Hajnoczky, G. Control of mitochondrial motility and distribution by the calcium signal: a homeostatic circuit. J Cell Biol. 167 (4), 661-672 (2004).
- Saotome, M., et al. Bidirectional Ca2+-dependent control of mitochondrial dynamics by the Miro GTPase. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (52), 20728-20733 (2008).
- Schon, E. A., Przedborski, S. Mitochondria: the next (neurode)generation. Neuron. 70 (6), 1033-1053 (2011).
- Petrozzi, L., Ricci, G., Giglioli, N. J., Siciliano, G., Mancuso, M. Mitochondria and neurodegeneration. Biosci Rep. 27 (1-3), 87-104 (2007).
- Maresca, A., la Morgia, C., Caporali, L., Valentino, M. L., Carelli, V. The optic nerve: a "mito-window" on mitochondrial neurodegeneration. Mol Cell Neurosci. 55, 62-76 (2013).
- Su, B., et al. Abnormal mitochondrial dynamics and neurodegenerative diseases. Biochim Biophys Acta. 1802 (1), 135-142 (2010).
- Vincent, A. M., et al. Mitochondrial biogenesis and fission in axons in cell culture and animal models of diabetic neuropathy. Acta Neuropathol. 120 (4), 477-489 (2010).
- Leinninger, G. M., et al. Mitochondria in DRG neurons undergo hyperglycemic mediated injury through Bim, Bax and the fission protein Drp1. Neurobiol Dis. 23, 11-22 (2006).
- Leinninger, G. M., Edwards, J. L., Lipshaw, M. J., Feldman, E. L. Mechanisms of disease: mitochondria as new therapeutic targets in diabetic neuropathy. Nat Clin Pract Neurol. 2, 620-628 (2006).
- Edwards, J. L., et al. Diabetes regulates mitochondrial biogenesis and fission in mouse neurons. Diabetologia. 53 (1), 160-169 (2010).
- Fernyhough, P., Roy Chowdhury, S. K., Schmidt, R. E. Mitochondrial stress and the pathogenesis of diabetic neuropathy. Expert Rev Endocrinol Metab. 5 (1), 39-49 (2010).
- Schmidt, R. E., Green, K. G., Snipes, L. L., Feng, D. Neuritic dystrophy and neuronopathy in Akita (Ins2(Akita)) diabetic mouse sympathetic ganglia. Exp Neurol. 216 (1), 207-218 (2009).
- Penna, G., et al. Human benign prostatic hyperplasia stromal cells as inducers and targets of chronic immuno-mediated inflammation. J Immunol. 182 (7), 4056-4064 (2009).
- Lentz, S. I., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In Vitro. J Histochem Cytochem. 58 (2), 207-218 (2010).
- Glas, U., Bahr, G. F. Quantitative study of mitochondria in rat liver. Dry mass, wet mass, volume, and concentration of solids. J Cell Biol. 29 (3), 507-523 (1966).
- Bertoni-Freddari, C., et al. Morphological plasticity of synaptic mitochondria during aging. Brain Research. 628 (1-2), 193-200 (1993).
- Kaasik, A., Safiulina, D., Zharkovsky, A., Veksler, V. Regulation of mitochondrial matrix volume. Am J Physiol. 292 (1), C157-C163 (2007).
- Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. Imaging axonal transport of mitochondria in vivo. Nat Meth. 4 (7), 559-561 (2007).
- Park, J. Y., et al. Mitochondrial swelling and microtubule depolymerization are associated with energy depletion in axon degeneration. Neurosciences. 238, 258-269 (2013).
- Court, F. A., Coleman, M. P. Mitochondria as a central sensor for axonal degenerative stimuli. Trends Neurosci. 35 (6), 364-372 (2012).
- Baloh, R. H. Mitochondrial dynamics and peripheral neuropathy. Neuroscientist. 14 (1), 12-18 (2008).
- Chowdhury, S. K., Smith, D. R., Fernyhough, P. The role of aberrant mitochondrial bioenergetics in diabetic neuropathy. Neurobiol Dis. 51, 56-65 (2013).
- Kennedy, W. R., Wendelschafer-Crabb, G., Johnson, T. Quantitation of epidermal nerves in diabetic neuropathy. Neurology. 47, 1042-1048 (1996).
- Lauria, G., et al. EFNS guidelines on the use of skin biopsy in the diagnosis of peripheral neuropathy. Eur J Neurol. 12 (10), 747-758 (2005).
- Lauria, G., et al. European Federation of Neurological Societies/Peripheral Nerve Society Guideline on the use of skin biopsy in the diagnosis of small fiber neuropathy. Report of a joint task force of the European Federation of Neurological Societies and the Peripheral Nerve Society. Eur J Neurol. 17 (7), e944-e909 (2010).
- Umapathi, T., Tan, W. L., Tan, N. C. K., Chan, Y. H. Determinants of epidermal nerve fiber density in normal individuals. Muscle Nerve. 33 (6), 742-746 (2006).
- Lauria, G., et al. Epidermal innervation: changes with aging, topographic location, and in sensory neuropathy. J Neurol Sci. 164 (2), 172-178 (1999).
- Lauria, G., et al. Intraepidermal nerve fiber density at the distal leg: a worldwide normative reference study. J Peripher Nerv Syst. 15 (3), 202-207 (2010).
- Hamid, H. S., et al. Hyperglycemia- and neuropathy-induced changes in mitochondria within sensory nerves. Ann Clin Transl Neurol. 1 (10), 799-812 (2014).
